菜鸟必读，乳胶微球免疫层析试剂研发流程

目前以羧基乳胶微球为主的层析试剂的开发已经被大多数人所接受，逐渐取代了胶体金的地位。此篇文章对乳胶微球层析试剂的开发做一个详尽的描述。

以乳胶微球为标记载体开发层析试剂，关键工序有以下几个：

1. 标记过程

2. 微球保存/稀释缓冲液的筛选

3. 包被条件的筛选 

4. 金标垫/样品垫是否需要处理？

5. 样本是否需要稀释？

一、标记过程

1.1活化条件的筛选

通常，研发人员会根据厂家的推荐，无脑使用10-50mM，pH6.0的MES溶液作为活化缓冲液，活化时间在15-30min。这里给大家一个建议：可以尝试一下使用不同pH的条件活化，如pH7.2-7.4的PB；如果考虑到盐离子的影响，可以尝试用纯化水进行活化。通常，结果会有很大的不同，这可能是很多人意料之外的地方。

1.2蛋白标记条件的筛选

通常，影响蛋白标记活性最大的就是标记溶液的pH。通常建议大家初试某对抗体的时候，尽量采用pH6.0的MES、pH7.2的PB、pH8.0的BB进行逐一筛选，避免由于标记pH的不合适而遗漏了本可以使用的抗体。

另外，盐离子浓度也是需要考虑的，通常建议大家最初使用10mM附近的离子浓度就可以了，高浓度的盐离子偶尔会引发微球的聚集问题。

蛋白标记量的筛选，也是十分必要的。标记量过低，灵敏度不达标；标记量过高，增加成本，并且灵敏度有时候反而会出乎意料的下降；标记量适中，也不见得就好，通常会引发微球的强交联。通常，微球厂家推荐的标记量在20-100ug/mg，建议大家仔细筛选一下。

1.3封闭条件的筛选

一般人会无脑使用1-10%的BSA作为封闭剂，也有人习惯用酪蛋白钠、鱼明胶作为封闭剂，还会有人用甘氨酸或者乙醇胺作为辅助，甚至有人用JSR等厂家的化学合成封闭剂。这个我倒是没什么建议的，一般我自己只用BSA就行了，很少添加其他的东西。

二、微球保存/稀释缓冲液的筛选

微球保存液和微球稀释液其实可以是相同的溶液，只不过不建议在微球保存液里添加过多的表活，以免引发稳定性的问题。

通常微球稀释液配方有这么一个公式：

缓冲体系+糖+蛋白+表活+大分子物质+防腐剂

缓冲盐对于微球影响大吗？其实挺大的，所以工艺验证初期，也尽量参考蛋白标记pH的筛选一样，对各个缓冲盐进行逐一尝试。

糖，一般就是指的蔗糖或者海藻糖，也可以是甘露醇，一般2-20%的浓度都会有人在用。个人建议浓度5%附近就可以，浓度太高了易吸潮，对于售往南方的试剂是个考验。如果热稳定性不好，通常使用海藻糖会更有利，但这个也不绝对。

蛋白，一般就是指的BSA、酪蛋白钠、明胶这些东西，跟封闭剂类似。我个人建议，在乳胶微球的稀释液里添加点酪蛋白钠，对于微球的分散性是十分有利的。很多人对于酪蛋白钠这个东西存在恐惧，怕影响灵敏度，这个我觉得还得试一下才知道。

表活，对于微球的分散性、释放度、显色情况都有影响，因此是筛选合适的表活是个非常有意义的事情。通常，吐温20具有普适性，也就是你在不知道用哪种表活的时候，可以先添加0.05-1%的吐温20，观察微球的整体释放和显色情况。而S9这个表活，是个愣头青，它可以极大程度地提升微球的释放和显色情况，但也让假阳的风险大大提升。相反，Triton×100像是个胆小鬼，它总是唯唯诺诺地，见到T线和C线总想绕着走，却渗透了NC膜的内部，通常微球残留比较严重。我个人喜欢对各个表活加以筛选，但是筛选重心不在这里，而是在样本稀释液里。

大分子物质，一般也就是指的PEG和PVP这些，说是在烘干的时候起到支架作用，并且提高微球的亲水性，使用浓度一般在0.1-1%之间。我个人一般很少在工艺初期添加进去，一般都是在样本稀释液里进行尝试，对比我没有很好的建议。

防腐剂，不必多说了，Proclin300可能是大家最常用的。但是对于免疫层析试剂来说，如果溶液现配现用，或者储存期限非常短，防腐剂即使不添加，又何妨呢。

三、包被条件的筛选

包被条件其实很简单，很多人直接用10mM pH7.2的PBS。但是我觉得，筛选一下合适的条件也是很有必要的。我个人总结了一个公式：

缓冲盐+糖+氯化钠(是/否)+蛋白(是/否)

通常缓冲液对于最终的显色影响不是特别大，但是这不是绝对的。采用PB、Tris、BB进行简单的筛选，可以让后续的实验没有后顾之忧。

通常认为，糖的加入可以提高热稳定性，而且有时候竟然有封闭的作用。如果前期糖的加入对于试剂性能没有什么影响，直接加进去就好了，反正没有什么坏处。

氯化钠就像是个双刃剑，有的项目能抑制假阳，提升显色强度；有的却相反，能引发假阳。所以氯化钠的加入与否，还是很有必要验证一下的。

这里的蛋白主要就是指BSA。同氯化钠一样，不同的包被原料，对于BSA的友好程度不一样。大多数情况，我们都是因为假阳，才会引入BSA，降低了假阳风险；或者由于原料亲水性差，引入了BSA，提升了显色强度。但这都不是100%的可靠经验，因此，蛋白的加入与否，一般出于没有办法的办法。如果对于最终的性能影响不大，可以适量添加一些，也是没有坏处的。

四、金标垫/样品垫是否需要处理？

我个人还是秉承能不处理，就不处理的原则。一是会增加徒劳的工作，二是会引入没必要的风险。

对于金标垫，若采用铺金的形式，那就完全没有必要前处理；若采用喷金的形式，那就尽量去筛选一些不需要处理的垫子，比如一些亲水性好的、质地比较均匀的聚酯垫。如果进行了前处理，由于处理液分布不均匀引发的结果变异大的问题反而会更令人头疼。

对于样品垫，一般分为两种情况。对于存在样本稀释液的，其实完全没有必要前处理，很多成分可以直接添加到样本稀释液里面就可以了；对于直接上样的，尤其是血清直接上样，样品垫的前处理就很有必要了，并且样品垫的材质要求也更高。由于每个人的血清的黏稠度相差非常大，干扰成分也是很难考量，所以到目前为止，针对于血清直接上样的试剂，我也表示很难做好，因此也没有什么很好的建议，只能过多地依赖于样品垫的材质。