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【冯仁丰】系列讲座 4 基质和基质效应临床实验室认识和实践 2 ...

归去来兮 2022-2-16 02:49 PM 1445人围观 技术

基质和基质效应临床实验室认识和实践

冯仁丰


本次微信就基质和基质效应的Rej观点做介绍。


Dr Robert Rej是中国检验界的好朋友。他多次来中国进行交流,学术渊博,为人和善。时间过得真快,基质和基质效应这两个词语,在我国临床实验室领域中,已经很熟悉了。有人说,这是美国CLSI的EP-14文件中介绍的。应该从它那里开始。但是,可能大家都不知道,提出建议使用基质和基质效应的这位人物是美国纽约州卫生厅的Dr Robert Rej。Rej博士一直在临床实验室工作,是纽约州临床实验室的检测质量评估的负责人。长期来,他极其关注实验室酶分析物酶活力检测质量。他注意到纽约州内的临床实验室,在检测几个常见的酶检测结果中,尤其是检测酶方法太多,严重影响检测结果的一致。在上世纪70年代,美国的自动化也刚刚开始。还有很多手动操作的检测方法。因此使检测结果一致,非常困难。他曾经设想,有一个酶的标准物质。让所有实验室都以这个酶标准为准,可以使检测结果一致。市场上为了适应实验室需求,研制和供应加工的冷冻干燥血清。这是为实验室开展质量控制用的。需要定值血清,由厂商请实验室定值。


Dr Rej想到,既然这是稳定血清,其中也有几个常见的酶活力的项目。何不就使用这样的稳定血清,让大家以这个定值控制品的酶靶值为准,校正实验室检测结果。是否可以使纽约州实验室酶检测结果一致?多次调查,他很快发现行不通。


以转氨酶为例。上世纪80年代初,纽约州实验室大多使用手工方法检测的是Reitman-Frankel比色法,以及Karmen速率法等。原先这两个方法调查结果的比值比较接近。但是,使用了有靶值的控制品校正后,这两个方法的结果比值变了!较原先比值要大!什么原因?


转氨酶的情况,非常说明问题。1956年,Karmen发明了速率方法进行转氨酶活力检测。这个速率法的原理大家现在很熟悉。以ALT为例。这是以丙氨酸和α酮戊二酸为酶反应底物。血清中的转氨酶反应产生了丙酮酸。然后在试剂中乳酸脱氢酶和还原辅酶I的存在下,将丙酮酸还原成为乳酸,同时氧化了还原辅酶I为辅酶I。由于还原辅酶I在340nm下有强烈的光吸收,随着乳酸产生,也同时消耗了等摩尔的还原辅酶I,使340nm下的光吸收下降的速率与丙酮酸产生速率相等。由此,建立了的紫外分光光度法。在手工操作时代,实验室没有高级紫外分光光度计。而且速率法的试剂成本很高。因此绝大部分实验室需要可以操作检测的比色方法。以转氨酶反应产生的丙酮酸,与2,4二硝基苯肼反应,产生苯腙;然后在强碱性下呈棕黄色进行比色测定。这是实验室可以接受的方法。但是底物中的多余α-酮戊二酸也会与苯肼发生相似反应,也成为棕黄色。产生严重干扰。所以,为了形成实验室可以使用的方法,发明者费尽心思,在降低底物浓度、限制苯肼用量等条件下,终于产生了比色方法。


在这样的检测方法下,产生的丙酮酸显色,无法真实反映转氨酶活力。Reitman-Frankel决定,不直接使用丙酮酸含量计算酶活力。而是以一组新鲜血清为中间传递手。使用Karmen速率法,确定各个血清内转氨酶的活力,以Karmen单位表示为X;同时这些血清在比色测定法上,按照Reitman-Frankel方法进行检测,以指定比色计上阅读得到的吸光度为Y。将许多血清得到的酶活力Karmen单位,与比色法的吸光度,绘制在坐标纸上。按照实验点的轨迹绘制出Karmen单位与比色法吸光度关系的曲线。这就是闻名的“Reitman-Frankel赖氏法”。这样的显色曲线,又经反复实验,确定了标准丙酮酸替代血清,参与显色反应得到的吸光度与相应酶活力反应吸光度一致。由此得到了“丙酮酸显色标准曲线”。


因此,如果有临床实验室直接使用Karmen速率法检测血清内转氨酶的活力,在一定范围内,它们的检测结果应该与“赖氏法”的比色方法得到的酶活力结果相仿!不会有很大差距。注意,这是使用“赖氏法”检测新鲜人血清,得到的酶活力结果在一定范围和条件下,与Karmen速率法酶活力结果等当。


可是,出现了稳定的控制品后,控制品生产厂商为了迎合实验室需要,请使用Karmen速率法的实验室、和使用比色法的实验室,分别为控制品定值。满以为没有问题。作为质量控制,应该是可以的。但是将这样确定的靶值作为实验室校正他们检测病人样品结果,出大问题了!因为,控制品不是天然的人血清,它们的基质状态发生了巨大改变,它们的定值不能代表天然血清会出现的结果!


这个现实,让Dr Rej知道加工处理过的控制品,不可替代天然血清!什么原因?Dr Rej的团队经过研究和实验,终于体会出,原来稳定控制品与天然血清间的基质发生了变化!引起了基质影响(Matrix effect)(现在我将它说成是基质效应)!Dr Rej的认识是一步步走过来的。非常不容易!


基质(Matrix)来自拉丁语的mater和希腊的μητηρ[meter],为母亲(mother)或子宫(womb),是口语表示周围物质。已经较早地定义基质(matrix),作为“物质的主要成分”和考虑的血清,特定的血清蛋白(如白蛋白)、和合成的物质(如聚丙烯吡咯烷酮)等作为基质。这与美国检测和物质定义协会完全一致:“某样品内主要的元素或样品中的元素。”(注意,这是Rej上世纪90年代的认识!)但是,基质较通用的定义,这里被考虑为“完整的周围或环境,某分析物和所有化合物(除了分析物之外)或属性存在的该环境中。”所以,若按上定义“基质效应”是由任何的、或所有的标本中其他成分引入的误差,必须被考虑为是一个干扰。词语基质干扰也被用于分析化学。那么,何时一个分析误差是因基质效应所致,还是干扰所致?“基质效应”通常将干扰归因于标本的主要或大部分成分,与我们原先严密的定义一致。例如,血清或牛奶蛋白对钙分析的干扰会通常以词语“基质效应”表示,而钙分析因镁的浓度的影响,则更通常被考虑是镁的干扰,尽管镁也是“基质”的一部分。标准条件的程序会被用来排除“基质效应”。


基质干扰是因物理化学性质(粘度、表面张力、真空压力、Donnan-相对的作用),而不是因较特异的化学干扰。“基质效应”经常被叙述为因生物标本中未知的或为不确定的物质或因子的干扰。Buttner在他对干扰的完整综述中,叙述了这个观察。事实上,国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)定义它为:“不可被确定的干扰,可使用词语‘效应’的情况。这样,基质效应是一个复合的干扰,因所有伴随物所致。”

TO BE CONTINUED

来源: 冯仁丰
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