人血清外泌体癌胚抗原检测在结直肠癌诊断中的临床应用

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结直肠癌是世界第三高发的恶性肿瘤，近年来我国结直肠癌发病率和死亡率正逐年上升，结直肠癌早期治疗效果很好，但由于早期症状隐匿，患者确诊时大多已发展到中晚期，错过了最佳治疗时期。因此急需寻找一种非侵袭性的、快速、简便的诊断方法，早期诊断标志物便是一种很好的方法，但当前诊断结直肠癌的血清标志物仍比较匮乏，常用的如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等。

外泌体(extracellular vesicles，exosomes)是广泛存在于血细胞、树突状细胞、肿瘤细胞等各类细胞中的囊泡样结构，在生理和病理状态下均可释放^[2]，由于EVs含有受体、生物活性脂质、蛋白、核酸等，故其可向受体细胞传递重要的遗传信息，是细胞间信号传递的重要途径^[3]，近期许多研究已表明，外泌体内包含的许多重要蛋白可以用于肿瘤的早期诊断^[4]，本研究通过分离并检测结直肠癌患者与健康人血清外泌体CEA的浓度，探究血清外泌体CEA用于结直肠癌诊断的可能性。

一、材料

1．主要仪器与试剂：

透射电子显微镜(PHILIPS公司)，Zetaview可视化纳米粒度仪(德国Particlemetrix公司)，酶标仪(Thermo Fisher公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CEA试剂盒购自上海武昊公司。血清CEA检测采用美国罗氏公司Cobas e601型全自动电化学发光免疫分析仪及原装试剂。兔抗人HSP70抗体、兔抗人CD63购自美国santacruz公司，羊抗鼠IgG二抗购自美国CellSignaling公司。

2．血清来源：

选择同济大学附属同济医院胃肠外科2015年10月至2016年12月确诊结直肠癌病例血清标本64例，其中男38例，女26例，年龄39～85岁，平均年龄(59±13)岁，其中分为血清CEA正常病例组41例(经电化学发光法检测血清CEA浓度值在正常参考范围内)及血清CEA增高病例组23例。选择同期良性结直肠疾病患者血清标本20例作为良性疾病对照组，其中男9例，女11例，年龄34 ～78岁，平均年龄(57±11)岁。选同期40例同济医院健康体检者作为正常对照组，其中男18名，女22名，年龄19～70岁，平均年龄(48±14)岁，年龄和性别与病例研究对象相匹配。结直肠癌患者诊断标准及分期、分型标准均依据美国肿瘤联合会第八版癌症分期系统^[5]，见表1。所有入组患者均空腹采集静脉血5 ml，室温静置30 min后3 000×g离心15min, 分离血清，－80 ℃冷冻保存。本研究经过同济大学附属同济医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书[(同)伦审-KYSB-2015-(10)]。

二、方法

1．血清外泌体提取：

血清标本取出室温复溶后，3 000×g离心15 min，去除残留细胞及细胞碎片，吸上清液250 μl至新管，加入ExoQuick试剂63 μl，充分混匀，室温静置30 min，1 500×g离心30min，弃上清，再次1 500×g离心5 min，弃尽上清，所得沉淀即为外泌体外泌体。

2．透射电镜下观察外泌体：

将离心所得的外泌体沉淀物用100 μl的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)重悬，取20 μl重悬液载样于铜网上，室温静置2 min，用滤纸从滤网侧面小心吸干液体，滴加3%的磷钨酸溶液20 μl，室温下复染3min，用滤纸从滤网侧面小心吸干复染液，双蒸馏水洗涤铜网5次，室温自然干燥后，透射电子显微镜下观察及拍照。

3．Zetaview可视化纳米粒度仪鉴定血清外泌体：

将所得的外泌体沉淀物用100 μl PBS重悬，充分混匀后，将所得样品用PBS进行1∶50 000稀释，并充分混匀，取混匀后样品300 μl上机，用Zetaview可视化纳米粒度仪进行粒径和浓度分析。

4．WesternBlot检测：

采用BCA法对外泌体蛋白定量，根据定量结果调整蛋白浓度，分别取外泌体沉淀物和去除外泌体的血清样品各20 μg，进行Western Blot检测。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(Sodiumdodecyl sulfate-Polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，将蛋白质电转印(4 ℃，250 mA，60 min)至PVDF，室温封闭1 h，分别加入兔抗人CD63和HSP70单克隆抗体(1∶2 000稀释)，4 ℃孵育过夜，次日用1×TBST洗膜，与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000稀释)室温反应60 min，洗膜，利用ECL化学发光剂(CST公司)显影，压片。

5．ELISA法检测血清及外泌体CEA浓度：

去除残留细胞及细胞碎片的血清样本用1×PBS 500倍稀释，外泌体沉淀用100 ml RIPA裂解液在冰上裂解半小时，充分振荡混匀，用1×PBS 3倍稀释。在CEA抗体包被的微孔板分别加标准品，空白对照，各组稀释后的血清及外泌体样品各100 μl，37 ℃孵育60 min，甩掉微孔板中液体，拍干，加入A液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，加入B液37 ℃孵育30 min，洗板5次，加90 μl底物，37 ℃避光孵育15 min，再加50μl终止液，立即在450 nm波长测定。

6．统计学方法：

采用SPSS 19.0统计软件包进行统计分析，经K-S检验，各组数据呈偏态分布，计量资料采用最小值-最大值(中位数)的形式表示，组间两两比较用Mann-Whitney U检验。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评价各指标对结直肠癌的诊断效能，各指标曲线下面积比较用Z检验，以P<0. 05作为差异有统计学意义。

一、血清外泌体

使用ExoQuick试剂盒对人血清外泌体提取，所有血清样本均提取到淡黄色脂样沉淀，即外泌体沉淀外泌体。

二、血清外泌体的形态特征

1．形态学鉴定：

透射电镜下观察，外泌体提取物均呈圆形或类圆形的小囊泡，直径约40～100 nm，包膜完整，背景清晰，未见细胞碎片。

2．Zetaview可视化纳米粒度仪鉴定血清外泌体：

利用Zetaview可视化纳米粒度仪对外泌体悬液内的粒子进行动态检测，结果提示，健康体检者血清外泌体的直径主要集中在40～150 nm，最大分布峰值为95.1nm，占比97.5%，浓度为3.9×1012个/ml，结直肠癌患者血清外泌体的直径主要集中在40～160 nm，最大分布峰值为99.5 nm，占比98.4%，浓度为3.3×1012个/ml。

3．Westernblot检测外泌体表面标记蛋白CD63、HSP70：

血清外泌体样本中可见明显的外泌体标志物CD63和HSP70的表达条带，而去除外泌体的血清上清液中二者均未能检测到。

三、ELISA法检测结直肠癌病例组、良性疾病对照组与正常对照组血清外泌体CEA浓度情况

ELISA法检测证实人血清外泌体中存在CEA。64例结直肠癌病例组外泌体CEA浓度为(1 056.36～28637.78)pg/ml，明显高于良性疾病对照组(394.61～2 437.83)pg/ml以及正常对照组(610.89～2 076.70)pg/ml，差异有统计学意义(分别U＝124.000，U＝119.000；均P<0.001)；结直肠癌病例组外泌体CEA与血清CEA正常病例组(1056.36～5 832.07)相比，差异有统计学意义(U＝1 002.000，P＝0.042)；血清CEA增高病例组(2 379.32～28637.78)与良性疾病对照组、血清CAE正常病例组及正常对照组相比，差异均有统计学意义(分别U＝68.000，U＝72.000，U＝62.000，均P<0.001)；血清CEA正常病例组外泌体CEA与良性疾病对照组和正常对照组相比，差异有统计学意义(U＝113.000，U＝119.000；均P<0.001)。

四、ELISA法检测结直肠癌病例组、良性疾病对照组与正常对照组血清CEA浓度情况

ELISA法检测41例CEA正常病例组血清CEA浓度为(15 298.01～75938.02)pg/ml，与良性结直肠疾病患者血清CEA浓度(31144.97～58 632.76)pg/ml比较差异无统计学意义(U＝405.000，P>0.05)，与健康对照组血清中CEA浓度(9 688.32～57950.80)pg/ml比较差异也无统计学意义(U＝664.000，P>0.05)；血清CEA增高病例组(26 704.16～578 230.74)与良性疾病对照组、血清CAE正常病例组及正常对照组相比，差异均有统计学意义(分别U＝56.000，U＝34.000，U＝48.000，均P<0.001)。

五、血清外泌体CEA对结直肠癌辅助诊断价值

图4利用ROC曲线分析外泌体CEA浓度对结直肠癌的辅助诊断效能，结果显示，血清外泌体CEA对结直肠癌诊断的ROC曲线下面积为0.954(95% CI＝0.919～0.988)，血清CEA对结直肠癌诊断的ROC曲线下面积为0.636(95% CI＝0.531～0.742)，二者相比有统计学意义(Z＝5.58，P<0.01)，说明血清外泌体CEA对结直肠癌的诊断效能优于血清CEA，当血清外泌体CEA的cut-off值为1648.51 pg/ml时，诊断效能最佳，此时其诊断结直肠癌的敏感度为84.4%，特异度为97.5%，表明检测外泌体CEA浓度是诊断肠癌的一项良好指标。