随着科技的进步，微生物鉴定日趋自动化，从传统的手工生化、药敏到半自动-全自动，从形态学到分子诊断，鉴定的范围越来越广，准确率也越来越高。现在对于感染性疾病都可以不用培养，直接用原始标本做基因检测，就能够判断有无病原菌，方便快捷。但是对于一些基层医院来说，这些高大上的实验暂时还是遥不可及。目前部分基层医院微生物设备简陋，有的医院还停留在只有一台显微镜、一台培养箱的局面。好点的基层医院最多有全自动生化药敏仪，质谱少有，测序更不可能，所以经典方法目前仍是基层微生物鉴定的重要手段，就算是全国的大医院，也得先培养、鉴定，实在鉴定不了的才上质谱或者测序。这些高大上的鉴定方法也有局限，鉴定率也非百分百，就算百分百，还得结合培养特性、染色特性、生物学特征等综合分析。所以说老祖宗传下来的经典方法不能丢，形态学依然是基础，所有高大上的方法都得结合疾病本身，结合培养与镜下形态综合分析，脱离实际你将得到错误的结果。下面是一个案例分享。
今年的一株全国室间质评菌株信息提示：女，23岁，免疫力低下，莫名高热，考虑菌血症可能，问：病原菌名称及药敏实验。转种血平板、巧克力平板、麦康凯平板，只有血平板生长24小时看见乳白色细小菌落，72小时菌落偏大可见狭窄溶血环，镜下为革兰阴性球菌，成双或者短链或者成堆排列。
从平板上看，菌落像阳性球菌，有透明的溶血环，但镜下是阴性球菌。以为是自己脱色久了，不应该呀，染了这么多年的革兰，这样的低级错误不该犯呀，何况同一张片子还有葡萄球菌、假单胞菌，都是很正常的颜色。
老手也会有失误的时候，又染了一次，严格按照操作规程，结果显示几乎还是阴性球菌，偶尔可见不起眼的阳性球菌，难道这个菌被抗生素作用缺细胞壁了？我们科目前只有一台半自动在使用，只能做葡萄球菌、链球菌、发酵菌和非发酵菌、奈瑟菌、嗜血杆菌（菌落形态不符，一般灰色，中等大小圆形凸起，或者灰色扁平，中等偏大，镜下多型性），而且嗜血杆菌在血平板上单独不生长，只在嗜血平板上生长，因为嗜血平板才能提供嗜血杆菌生长所需要的X因子和V因子。这个菌镜下是阴性菌，首先做了氧化酶实验，阴性，同时也做了触媒实验，阴性，可以排除奈瑟菌和嗜血杆菌，因为它们的触媒均为阳性，也可以排除常见的发酵菌和非发酵菌，因为它们在麦康凯会生长，也排除葡萄球菌属，葡萄球菌属触媒阳性，而此菌触媒是阴性，会是链球菌吗？
链球菌触媒阴性，但是我所做过的链球菌染色都是紫色的，非红色的，由于链球菌细胞壁较厚，不易脱色，革兰染色成阳性。难道是细菌的菌龄长了？我染的时候已经差不多72小时了，会不会新鲜的菌染色结果不一样。于是对该菌进行转种，18小时后又染了一次，如图。
这次镜下球菌阴阳都有，到底是阳性菌还是阴性菌，我得把它区分开来，才能够选择上什么样的生化板条。上错板条会出错误的细菌，得出错误的药敏（比如对天然耐药的判断，不同菌天然耐药不一样，不同菌对抗菌药物的敏感程度也不一样），于是想到经典的拉丝实验。用4%的KOH一滴，滴在玻片上，再多涂点细菌，均匀研磨，拉丝阳性者为阴性菌，拉丝阴性者为阳性菌，选择大肠杆菌为阳性对照，葡萄球菌为阴性对照，看下图。
目标菌拉丝实验阴性，说明该菌是革兰阳性菌（最近一次染色也阴阳都有）。革兰阳性球菌，触媒阴性，菌落中等大小，有狭窄溶血环，那应该选择上链球菌的鉴定卡和药敏卡。24小时培养后，仪器鉴定出溶血孪生球菌（一种少见菌，鉴定率100%），对多数药敏感，包括万古霉素敏感，觉得鉴定结果比较靠谱。大家都知道绝大多数的阴性菌对万古天然耐药的，因为阴性菌有两层膜，内膜和外膜，万古霉素分子量大，不能透过外膜，阳性菌有五肽交链，结构疏松，万古霉素容易透过。
孪生球菌隶属于细菌域，厚壁菌门，芽胞杆菌纲，芽胞杆菌目，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）。1961年由Berger首先提议建立的一个菌属，当时只有1个菌种组成，即溶血孪生球菌（G.haemolysans）。由于该菌在革兰染色时，有些菌易脱色而染成阴性双球菌，也有的被染成阳性双球菌，故在此之前（1938.Thjotta等）曾分类于奈瑟菌属（N.haemolysans）。
1988年，Killpper-Balz等提议将麻疹链球菌（1974,Prevot,S.morbillonum）归入孪生球菌属，命名为麻疹孪生球菌（G.mrobillonum）。在此之前，此菌曾被分类为麻疹双球菌（1933,Prevot）、消化链球菌（1974.Holdeman）。1993年，美国细菌学家Whithey和ConnorS通过16S rRNA序列分析，证明溶血孪生球菌与麻疹孪生球菌之间具有很高的同源性。
再查一下东科图谱，溶血孪生球菌，菌体细胞呈球状，0.5-0.5μm×0.5-1.4μm。常以成对、短链、成堆出现，革兰氏染色阳性或可变，细胞壁虽是革兰氏阳性，但易褪色。不运动，不产芽孢。兼性厌氧，但初分离时在空气中不生长。在兔或马血平板上的菌落小，并常以α或β溶血。化能异养菌，生长需要含蛋白胨的丰富营养。发酵葡萄糖和PYP实验阳性，接触酶阴性，氧化酶亦阴性。明胶不液化。最适生长37℃，10℃和 45℃都不生长。
为人的口腔、肠道和呼吸道的专性寄生菌，溶血孪生球菌造成的感染临床上极为少见，免疫力低下人群除外，文献报道从患者脑脊液、尿液、脓液及血液中分离到过，因此对溶血孪生球菌感染患者，要积极通过辅助检查和实验室检查准确诊断感染性质，积极查找感染病原菌，以助诊治。
孪生球菌从形态上易与奈瑟氏菌（触媒、氧化酶阳性）、韦荣氏菌（紫外线照射发出红色荧光）相混淆，都是阴性小球菌，都是呼吸道、胃肠道、泌尿道正常菌群，但每个菌都有不一样的特点。
孪生球菌生物学性状和引发人类感染的疾病都与草绿色链球菌很相似，应注意鉴别。一些生长缓慢的孪生球菌，容易误认为营养缺乏的乏养球菌和颗粒链菌，后者点种金葡有助其生长作用，而孪生球菌点种金葡无协同作用，孪生球菌卫星实验阴性。
我们通过手工生化实验以及氧化酶、触媒、拉丝实验、卫星实验、CAMP均(-)，菌落形态和镜下形态鉴定为溶血孪生球菌，而文献上的溶血孪生球菌的生长特性和菌落特征、染色特性的描述也符合我们培养平板的菌落特征和镜下形态。
这株菌听闻有的同行按照镜下特点，以奈瑟菌的鉴定思路鉴定得出了鉴定率较低的结果（明显的上错卡，最基本的实验都不相符，触媒、氧化酶）；有的按照链球菌的思路得出了不同的链球菌的结果，虽然鉴定率高，但是不明所以，阴性菌为何要上链球菌的板条，甚至都没有结合菌落形态，分析得出来的这个菌名是否符合实际；有的单位就直接上质谱鉴定，殊不知质谱对链球菌的鉴定率并不高，因为阳性菌的细胞壁厚，不容易破壁。
我们不管走多远，也不能忘记当初是怎么开始的，再先进的仪器设备，也是从最基础的实验原理设计而成的，人才是仪器的主宰。如果从事微生物，最起码的形态学不能掌握，最起码的鉴定手段不知晓，当先进设备出现问题或者故障，你就束手无策，真的就是仪器的奴隶。只要我们基础知识掌握牢固，手工方法一样能够鉴定出高大上的少见菌。
