【冯仁丰】系列讲座 3 基质和基质效应临床实验室认识和实践 1 ...

基质和基质效应临床实验室认识和实践

冯仁丰

一、基质和基质效应的定义

基质（Matrix）-- 除了分析物之外，某物质形态内的所有成分（对ISO 15193的修改）。

基质效应（Matrix effect）-- 样品某个性质，与存在的分析物无关，对检测的影响和检测量值的影响（JCGM 200:2012）；注：基质的物理化学作用（如，干扰）对准确检测某分析物的检测程序能力的影响。这是美国CLSI EP14-A3对基质和基质效应的定义。

因此，一个检测样品内，除了有目的需要检测的分析物之外，在样品中所有其他非分析物，就是该分析物的基质。不同检测项目的分析物与基质对，它们一直在互相变换。例如，检测葡萄糖时，样品中非葡萄糖的所有组分是葡萄糖在检测中的基质。这个样品在被检测肌酐时，样品中的非肌酐组分，就是肌酐在检测中的基质。

第二，注意，所有基质包围在分析物的周围。因此，是检测中分析环境因素对分析物被检测的影响。造成基质效应（effect）。因为我说成是效应，也可认为是作用、影响。没有检测，对样品无所谓基质和分析物。只有在检测中，分析物成为加入试剂、或被检测环境下攻击的目标，此时，在整个分析中包围分析物的样品内基质外；其实更重要的是试剂与分析物反应中，因为不同试剂批号、不同厂商的试剂盒等很多因素的差异，造成与分析物检测结果的差异。在某种程度上，试剂间的差异，也可视为基质效应。

二、手工操作年代如何克服基质效应

上百年前，在临床实验室开始有了化学分析。对病人样品进行检测中，一直被分析物受到基质效应影响的困扰。Folin对尿液中的肌酐，发明了碱性苦味酸与肌酐的反应，形成棕红色。可以比色测定。但是Folin在检测人血清肌酐上，没有解决问题。是他的学生吴宪，拜了Folin作为博士生导师后，经过实验确定，采用钨酸钠与硫酸混合形成钨酸，沉淀血液中的所有蛋白。然后使用碱性苦味酸，检测滤液内肌酐。这个过程，克服了全血中除了分析物之外，包含的血液中的有形细胞和所有的血液蛋白等的基质，对肌酐显色的影响。解决了血液内蛋白在碱性条件下形成沉淀，无法比色的困境。

吴宪的无蛋白血滤液后来在全世界推广应用，一直被称为Folin-Wu方法。确实解决了很多临床化学项目的检测。其实，无蛋白血滤液消除了这些被检测分析物周围的基质，在检测时具有的基质效应。也因为有了无蛋白血滤液方法，可以实施很多临床化学的项目的检测。我参加检验工作，学习的第一个事，就是如何做好无蛋白血滤液。我记得，老检验说：做好无蛋白血滤液，加上标准好，这个项目绝对没问题了！回想上世纪60年代到80年代初，国内临床实验室开展检测的很多分析物检测方法，多涉及沉淀、抽提、电泳分离等繁琐手段。所有这些标本前处理的程序，其实都是为了克服分析物与其周围的基质，对它检测中具有的基质效应。只是，当时我们没有意识到，这些都是进行分析物检测前，去排除基质效应的必须手段。

三、满足人们对健康的需求，对临床实验室提出了新要求

随着世界大战阴影离开人们越来越远，生活条件改善，促使对医疗卫生事业提出更多的要求。临床希望临床实验室开展更多的检验项目；要求提高效率更快地提供病人检测报告。工业上的自动化，在吸引临床实验室去实现检测的自动化。

上世纪50年代，世界上出现了第一台自动生化分析仪。它的出现推动了临床实验室检验速度，但是必须改革原先的手工传统方式。因此在临床实验室从内部到整个社会，需要配合自动化的改革，也许是临床实验室的革命开始了。从上世纪40年代，出现了临床实验室随着检验事业发展，检验人员强调了检验质量。学习工业上开展质量控制的方法，在实验室内使用多余病人标本进行了质量控制。实验室开展质量控制。需要稳定和大量的控制物质。这样，刚刚出现的体外诊断产业，除了发展仪器、试剂盒外，也开始了研制质量控制物质。促进开发了满足临床实验室的控制品和校准品、室间调查样品的研制。

四、控制品、校准品的稳定血清产品触发了深入认识基质效应

控制品、校准品等引入的基质效应。各种内部质量控制和室间调查用的控制品(controls)，和校准品(calibrator)，都经过加工处理，例如：冰冻、冷冻干燥、加稳定剂、添加某些分析物等，都是处理过的样品(processed sample)。它们都不是日常检验的新鲜病人样品。“处理过样品”（Processed Sample）的名称是因为：1、新鲜的原血清无法长期保存，必须对它进行防腐处理。或是加入防腐剂、或是冷冻干燥。2、冷冻干燥处理后使血清内含脂蛋白变性，复溶液体变得浑浊；而且这样的浑浊随着冻干血清保存时间的延长越来越严重。对使用带来困难。3、为了尽可能使复溶的冻干品变得清晰，厂商在制备中，先行去除α-脂蛋白，又经透析等处理。4、原有混合血清内各个分析物浓度不理想。对于过多的分析物采取透析或沉淀、吸附等处理；对不够的分析物则采用加入各种非人来源的原料，使其达到“理想”的水平。但是，这样处理后的原混合血清就与新鲜血清样品间产生了新的基质差异。

在平时,检测新鲜病人样品时不常见的偏移（bias），在检测处理过样品时却常见，因为在处理过样品中有新鲜样品所没有的基质变化。这是新鲜样品与处理过样品间的基质差异产生新的基质效应。

面对美国CLIA压力美国临床实验室召开美国CAP第23届年会应对政府要求更增强认识基质效应。

1988年，美国政府决定，凡是在美国开业的临床实验室，都必须接受CLIA的认可；都必须定期接受政府委托的组织室间质量评估机构发送的样品检测，若检测结果不符要求，实验室将被停业整顿。问题是，发送的样品都是加工处理过的样品。与每天新鲜病人样品间具有显著的基质差异。如何处理？

临床实验室本来就有一个梦，一个病人样品走遍世界，在任何时候和任何地方的临床实验室，检测得到的结果是一样的，即具有一致性、可比性。注意，这是新鲜的病人样品的表现。控制品的出现被大家认为这是一个稳定的样品，它可以替代新鲜样品起到这样的效果。可惜，控制品、校准品、调查品都是加工处理过的样品。已经引入了严重的基质差异！不幸的是，用于评估实验室间准确度的处理过物质，它们的反应性质不同于病人标本。在反应性上的差异可来自人来源的血清等基质的修饰，因添加物、因稳定化的过程如冷冻干燥、或因使用了非人来源的物质。基质修饰影响到分析响应的是一个复杂的方式，因各种机制所致。这些包括大分子结构和溶液粘度的物理变化、稳定处理的添加剂、非人的分析物添加物、在天然样品和校准、控制检测物质间的蛋白异构化等，这些却从来没有在病人标本中出现过。推动关注基质效应进展的动力是CLIA’88的法规。法规要求使用能力验证去评价实验室结果的质量。但是分析系统对处理过样品和新鲜病人标本间的分析物反应性质差异很灵敏，无法反映实验室每天在检测新鲜病人标本具有的质量现状。需要一个使用处理过样品进行质量调查，做出较合理的评估方法。

注意到每个固定的仪器/试剂系统（即检测系统）对调查样品的检测具有的基质效应影响是一致的。如果按照固定检测系统分类，以具有相同检测系统实验室检测调查样品结果均值为靶值，这些实验室检测结果相对于该均值的偏移，同样具有评估实验室水平的价值。具有相同检测系统的实验室组合，被称为“对等方法组”。PT名称也因此产生。暂时解决了因调查样品具有的基质效应引入的问题。以对等方法组（Peer group）建立各个固定检测系统的靶值，去确定该对等方法组内某实验室的检测结果是否与使用相同方法的其他实验室一致，但是不强调某方法或实验室是否对分析物得到准确的检测。这个做法1992年在美国开始的能力验证考核中正式实施。影响了全世界。这是CAP第23届年会的一个重大成果。

为了说明基质和基质效应的观点，大会邀请Dr Rej做20年酶检测认识基质和基质效应的报告。是这个报告说明了基质和基质效应在临床实验室中使用的来历。邀请Dr Fred Lasky，介绍如何在强生干片上进行校准品定值，使干片上得到的病人检测结果，与一般分析仪上的一致。这个报告为以后厂商检测校准品定值的做法，打下了基础。在这次大会上，Dr Rej被邀请做了这个报告。可以说，是他经历了20年的研究和探讨酶活力检测质量管理的总结，也点出了基质和基质效应的来历；以及为什么要用这两个词汇。