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病毒学检验技术是用实验室检验方法对临床和流行病学现场送检的标本（如人或宿主的血液、组织、尿液、粪便和组织液等）进行病毒学的定性和定量分析，为病毒感染和病毒性疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。 标本的采集、处理与运送 根据临床诊断及病期采集不同的标本,用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集,要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。
病毒的抵抗力通常较弱,在室温下很快灭活,标本采集后应立即送到病毒实验室,暂时不能检查或分离培养时,应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲亚砜(DMSO)并防止反复冻融使病毒灭活,存放在-70℃低温冰箱内保存。
病毒的培养条件 实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞都可以作为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断试剂的先决条件。
病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用,可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过对“指示病毒”的干扰等方法加以识别。组织培养用的玻璃器皿要求比较严格,要用硫酸和重铬酸钾溶液浸泡后再清洗应用。常用于组织培养的人工综合营养液的主要成分有氨基酸、糖类、无机盐、维生素和辅助生长因子等,常用的人工综合营养液为MEM何RPM I 1640.用人工综合营养液配制细胞生长液时需要加入适量血清和谷氨酰胺溶液,还需要加入规定量的抗生素溶液防止细菌污染,加入碳酸氢钠溶液修正pH,根据情况还可加入HEPES溶液可使生长液具有较强的pH缓冲能力。能使组织和成片细胞分散成单个细胞的化学制剂为胰蛋白酶和EDTA,EDTA使用液又可称之为Versen 溶液,其分散细胞的作用原理是EDTA可以结合钙、镁离子,使组织细胞分散。动物血清中具有细胞生长所必需的各种营养因子,它能促进细胞的贴壁和生长,具有很强的酸碱缓冲能力。细胞培养液在细胞培养过程中可分为细胞生长液和细胞维持液两种。 生长液是使细胞发育增殖的液体,因此要求营养条件丰厚;维持液用于延缓细胞代谢,从而延长细胞的存活时间,以利于实验的进行。这两种液体成分的主要区别是血清含量不同。细胞生长适宜的pH范围是7.2~7.6。细胞培养技术全过程的关键是防止污染。细胞株的保存时组织培养中一个十分重要的工作,二甲亚砜是细胞低温保存的良好的保护剂,含10%二甲亚砜的血清可以作为悬浮细胞的液体在液氮中保存细胞。病毒学上常用的细胞类型可分为原代细胞、二倍体细胞和传代细胞三大类,原代细胞培养和传代细胞培养的根本区别在于细胞是否能在体外无限传代。细胞的纯化可以用细胞克隆技术。克隆是指用无性繁殖方法产生的一组遗传上相同的细胞和生物群体的过程。病毒病的常规实验室诊断 (一)病毒的分离和鉴定 用于病毒分离的材料,无论是传代病毒培养物,还是采自发病或死亡动物的病料,都应尽快送往实验室作病毒分离或鉴定。组织细胞或动物接种和传代可以用于病毒的分离和鉴定。病毒对细胞的感染性具严格的选择性和特异性,因此细胞组织培养细胞接种病毒必须首先选择敏感细胞。
1、病毒增殖的判定 病毒在实验动物体内和组织培养细胞内增殖,显然都会影响机体和细胞的代谢和生命活动,并且经常通过一定的形态学和病理学变化表现出来。
2、细胞病变(CPE) 大部分病毒在敏感细胞系均可出现CPE,CPE可以表现为严重的细胞破坏、细胞重大、颗粒增多、细胞融合成合胞体或无明显的细胞变化等。
CPE经常具有病毒“种”的特性,因此常常作为病毒鉴定的依据之一。 3、病毒蚀斑(又称空斑)技术 病毒蚀斑是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶,主要用于病毒的纯化或病毒悬液中感染病毒含量的测定。 4、病毒感染力的滴定 常用的病毒感染力的滴定有两种方法,一种方法是用实验动物测定LD50(半数致死量),另一种方法是在组织细胞上测定TCID50(半数细胞培养物感染量)。 5、病毒的保存 (二)病毒形态学检查 快速有效的标本制作技术固然重要,但更需要识别病毒结构的经验。病毒形态学检查方法主要有:1、光学显微镜 仅用于大病毒颗粒(如痘类病毒)和病毒包涵体的检查。 2、电子显微镜检查法 某些病毒感染的早期,临床标本中就可以出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染,电镜下直接观察,可发现病毒颗粒,获得诊断。
将病毒标本制成悬液,加入特异性抗体、混匀,使标本中的病毒颗粒凝集成团,再用电镜观察,可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异,更敏感。 3、超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液,将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚,或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜,从而估计病毒的大小。 4、超速离心法 根据病毒大小的不同,其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数(S),借以计算病毒的大小。 5、X先晶体衍射法 根据X线衍射图谱,用数学方式处理来研究爱病毒结构亚单位和分子结构等。
总之,了解病毒的形态结构,并利用电镜技术去观察病毒,不仅是了解病毒本质所必需的,也是临床诊断和鉴别诊断所必不可少的。
近年来,利用特异的血清抗体去凝聚病毒材料里的未知病毒,并最后用电镜直观加以显示,从而实现特异而快速的病毒鉴定,这对现代预防医学和基础医学都有重大意义。它可以诊断抑制的病毒疾病,又是研究和发现新的未知病毒的有效手段。 获得病毒株后,应用抑制的抗病毒血清或单克隆抗体进行免疫-血清学试验,鉴定病毒的种类乃至型别。 分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性,病毒的分子生物学鉴定,包括对病毒核酸和蛋白质的测定。核酸测定主要使用聚合酶链反应技术、探针技术和核酸序列测定,检测病毒基因组中的特征性区段甚至整个病毒基因组;而蛋白质测定可使用免疫测定技术、电泳技术和质谱技术,检测病毒特异的蛋白质成分。 |
