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遇上仪器鉴定不出来的细菌,怎么办?

面气灵 2019-3-28 09:51 AM 2181人围观 技术



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前言
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近年来,临床微生物检验技术发展迅猛,各种自动化仪器鉴定细菌已是非常普遍,不仅为我们的细菌鉴定药敏解决了难题,也大大地缩短了临床的诊治的时间。但是高度依赖仪器鉴定的同时也引申出其他的问题,如果遇上仪器鉴定不出来的细菌怎么办?我们是否还记得利用手工的小实验来将它的真面目公布于众?2019年1月本人在北京医院微生物实验室就遇到了一个容易出错又较常见的菌,在老师的指导下利用小实验来一步步揭开它的真面纱。检验医学网


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细菌鉴定经过
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2019年1月27日一血培养需氧瓶报阳,立即取出转种哥伦比亚血平板、中国蓝、巧克力平板,涂片,紫外照射杀菌半小时后固定,革兰染色。很明显成双的革兰阳性球菌(见图一),马上给临床报危急值,自认为完美地解决了一个问题。


图一血培养瓶原始涂片

(革兰染色,x1000)


1月28日取出转种的三种平板,发现中国蓝、巧克力平板上均无细菌生长,只有血平板上长了白色半透明、光滑、湿润、不溶血的针尖大小菌落,看起来不像革兰阳性球菌的菌落形态,倒有点像革兰阴性菌的菌落形态!顿时我心里一惊,立马取菌落涂片染色镜检(见图二1,2)。检验医学网


图二(1)SBA  24h


图二(224h菌落涂片(革兰染色,x1000)


怎么镜下有阴有阳,且革兰阴性球杆占大部分!问题出在哪里?心里咯噔一下,立马拿着染好的片子和血平板给陈东科老师看看,陈老师一看点了下头,但是没立即告诉我们答案。陈老师说:“上机鉴定需要好几个小时,而质谱也需要等上午其他标本看完了一起打,现在你们完全可以利用一些小实验来佐证一下你心中的猜想,而这些小实验只需要几分钟的时间就能给你指明方向。”于是我马上着手,首先需要确定它到底是革兰阳性还是革兰阴性。拉丝实验做起来,明显的阳性(见图三1,2),说明此菌是革兰阴性菌。


图三(1)4%KOH拉丝试验原理


图三(2)拉丝实验阳性


它是革兰阴性的球杆菌!内心不由忐忑起来,昨天给临床报的是革兰阳性球菌。赶紧拿出氧化酶,触酶试剂做起来。氧化酶阳性,触酶也是阳性,且镜下形态为中等大小的球杆状,排除了布鲁菌属、“HACEK”细菌群、丛毛单胞菌属等等,考虑为奈瑟或莫拉菌属,再加上它有阴有阳说明有耐脱色的倾向,结论慢慢开始向莫拉菌属靠过去。拿出手机打开电子书《实用临床微生物学检验与图谱》查找莫拉菌属,显示的前两张镜下图片就与我们的菌落涂片一模一样(见图四)!检验医学网


图四 奥斯陆莫拉菌形态


这一系列的过程不过三五分钟。“陈老师,它会不会是奥斯陆莫拉菌?”“是不是奥斯陆莫拉还需要鉴定,不能说和图谱长得像就确定是它,但基本上已经可以肯定它是莫拉菌了,你现在需要做的是马上和临床医生沟通,血培养昨天初步报的革兰阳性球菌,要和临床医生说明是莫拉菌属本身具有的抗脱色性能,导致初步涂片未能初步确定应该是革兰阴性球杆菌。虽然等会可以质谱或上机鉴定,但是你可以加做L型诱导实验等,来佐证这球杆到底是球还是杆,也可以加深你的印象。”陈老师说。于是马上电话和临床沟通,打完电话我又疑惑了:“但是它若是莫拉菌属的话,应该巧克力平板上也会长,为什么这个菌没有长呢?”。陈老师说:“这个问题问得好,你想想巧克力平板里有什么成分,什么原因导致它巧克力平板上没长。”“明白了,等会做L型诱导实验的时候,加贴一个万古霉素的纸片,看明天它是否有抑菌环。”上午十一点待其他标本处理完将该菌一起打质谱,确定该为奥斯陆莫拉菌(质谱峰见图五)。


图五   奥斯陆莫拉菌质谱峰图


那么,该实验L型诱导的原理是什么呢?陈东科,孙长贵编著的《临床微生物学检验图谱》电子图书快速给了我答案(见图六、图七)。


图六  L型诱导原理(1)


图七 L型诱导原理(2)


1月29日早上到科室赶紧拿出昨天加贴了青霉素和万古霉素纸片的血平板,果然二者都有大的抑菌环(见图八)。检验医学网


图八 SBA 24h青霉素和万古霉素抑菌环


取青霉素抑菌环边缘的菌落涂片、革兰染色,非常漂亮的L型革兰阴性杆菌(见图九,图十)。检验医学网


图九  取青霉素抑菌环边缘菌落


图十  L型奥斯陆莫拉菌(革兰染色,x1000)


结果显示它是对万古霉素敏感的且为革兰阴性杆菌的奥斯陆莫拉菌。至此真相大白,解除了我心中的疑惑,也让我见识到了在仪器鉴定为主流的今天,被丢弃已久的手工小实验对细菌菌属鉴定不一样的优越性。检验医学网


经验与总结

➤染色的好坏直接影响革兰阴阳性菌的判断。


➤基本的小实验如拉丝实验、氧化酶、触酶、凝固酶等对细菌的鉴定起着非常重要的作用。另外在大数据时代的今天,电子书因方便携带、随时可查阅等优点,对我们微生物的日常工作帮助巨大。


➤不能过度依赖仪器鉴定,仪器也有鉴定错误或板上的鉴定范围不包含所需鉴定的细菌,及上板错误直接导致鉴定结果异常。因此,具有一定的形态学基础及扎实的微生物知识储备和丰富的经验在微生物室工作中非常重要。


陈东科老师点评

通过这株菌的鉴定看得出来同学们是用了功的,值得表扬。随着现代化进程的加速,医学现代化也是突飞猛进,很多实验室用上了质谱仪,甚至少见菌可以用分子测序的方法进行鉴定。


但是,任何方法都有其优点和不足,不能完全迷信,这一点往往被忽视了,认为花几百万买的设备应该是不会出错的。真是这样吗?等你用了一段时间认真体会后就会后悔前面的报告有很多可能出问题了。所以,当你的专业知识储备到一定的水平时,你出报告时就会越不自信,尤其是少见菌,这说明你进步了。


无论是用分子测序、质谱、或是其他方法来鉴定细菌(真菌),总有一些菌是鉴定不出或是鉴别不出(到种的水平),这时候就需要采用最传统的方法(形态学及基本的生化特征)来进行鉴别。


比如本文中鉴定的莫拉菌属,该菌鉴定到属问题不太大,但是要鉴定到种就有难度了(无论用哪种鉴定方法)。这就需要我们利用掌握的基础知识进一步鉴定或鉴别,所以说,买了高大上的仪器设备,但基本的操作技能不能丢。这也是进修生要重点学习和掌握的内容。希望你们多多总结经验,分享给大家。


【参考文献】

[1]陈东科,孙长贵.《临床微生物学检验图谱》电子图书

[2]王辉,马筱玲,钱渊,李若瑜等,译.《临床微生物学手册》(第11版)

[3]张秀珍,朱德妹.《临床微生物检验问与答》(第2版)



原作者: 岳阳市二人民医院检验科微生物室 易杏桃 来源: 岳阳市二医检验科
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