结核感染T细胞斑点试验在结核病诊断中的应用评价

结核病是严重危害人类健康的呼吸道传染病之一，临床症状出现较慢，临床表现不典型，可累及全身各个系统，病程前期易漏诊且病程较长^[1]。其造成的死亡人数仅次于艾滋病，被列为我国重大传染病之一^[2]。流行病学调查结果显示，我国结核分枝杆菌（MTB）感染的人数超过5亿，结核病患者人数仅次于印度居全球第2位，每年新发病例150多万，约13万人死于MTB感染^[2,3,4]。但迄今为止，临床上用于MTB感染的检测方法依然是抗酸涂片和结核培养，存在阳性率低、检测周期长、敏感度和特异度不高等缺陷^[5]。早期、快速诊断并治疗结核病是控制MTB感染和传播的主要措施。本研究通过酶联免疫斑点法（ELISPOT）对体外特异性免疫应答的T淋巴细胞进行计数来定量分析，采用的试剂是结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）试剂盒^[6,7,8]。比较了T-SPOT.TB、抗酸涂片、MTB培养和MTB核酸（MTB DNA）检测4种方法对诊断结核病的临床应用价值，现报道如下。

对象与方法

一、研究对象

收集云南省传染病专科医院2010年10月至2015年10月门诊及住院高度怀疑有结核病患者的病例资料，共2 016例，其中男1 212例，女776例，年龄在6月龄~91岁之间，平均年龄42.5岁。

二、方法

1．T-SPOT.TB

试剂：英国Oxford Immunotec公司生产的T-SPOT.TB试剂盒。仪器：Heal Force二级生物安全柜。Rivco CO₂孵育箱（每周更换新鲜纯水以保证湿度）等。检测方法：所有操作均严格按照试剂盒的说明书进行。结果判读：阴性孔斑点计数<6时，抗原A或抗原B检测孔斑点计数-阴性孔斑点计数≥6判为阳性；阴性孔斑点计数≥6时，检测孔斑点计数≥2倍阴性孔斑点计数判为阳性；阴性孔斑点计数≥6时，检测孔斑点计数<2倍阴性孔斑点计数，判为不确定，需重新实验。

2．涂片抗酸染色

参照萋-纳氏抗酸染色原理并按SOP操作，用干燥无菌容器收集患者留取的痰样本（每个患者送检3份痰样本：晨痰、即时痰、夜痰），然后将痰样本的一部分用无菌棉签涂于干燥的载玻片上，待载玻片自然风干后再在火焰上固定之后进行萋-纳氏抗酸染色，最后将染色后的载玻片置于油镜下观察并计数抗酸杆菌，以每100个视野查见抗酸杆菌≥3个为阳性。

3．MTB DNA检测

试剂盒及仪器均购自广州市凯杰股份有限公司，采用定量PCR方法，按MTB DNA检测试剂盒说明书进行操作。

4．MTB培养

各类样本按《结核病诊断细菌学检查规程》接种罗氏培养基进行结核菌培养，接种后每日观察，生长菌落后从罗氏培养基上挑取菌落涂于干燥的载玻片上，待载玻片自然风干后再在火焰上固定之后进行萋-纳氏抗酸染色鉴定。涂片阳性的样本收集进行MTB DNA检测，以确定是MTB感染或非MTB感染。第8周无菌落生长方可报告为阴性。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件，采用χ²检验比较各组数据，P<0.05为差异有统计学意义，并通过计算Kappa值确定4种方法的一致性，Kappa<0.40为一致性较差，Kappa值介于0.40~0.75之间，一致性中等，Kappa>0.75为一致性较好。

结果

一、T-SPOT.TB、抗酸涂片、MTB培养和MTB DNA检测4种方法检测阳性率比较

应用抗酸涂片、MTB培养、MTB DNA检测和T-SPOT.TB检测方法对所有受检人群MTB感染情况进行检测，阳性率分别为9.6%、14.8%、20.8%和43.3%，差异有统计学意义（χ²=416.496，P<0.05），认为4种方法检测结果阳性率不同，且T-SPOT.TB阳性检出率较高，见表1。

二、T-SPOT.TB与抗酸涂片、MTB培养和MTB DNA检测的一致性评价

T-SPOT.TB与抗酸涂片、MTB培养和MTB DNA检测的一致性评价结果显示Kappa值分别为0.164、0.173和0.243，均小于0.40，一致性较差。抗酸涂片与MTB培养和MTB DNA检测的一致性评价结果显示Kappa值分别为0.525、0.441，一致性中等。MTB培养与MTB DNA检测的一致性评价结果显示Kappa值为0.591，一致性中等。结果见表2。

讨论

近年来结核病发病呈上升趋势，其中传染源未能有效发现并控制是其流行的重要原因^[9,10]。加强实验室质量控制、提高MTB检出率、及时发现传染源是治疗和控制结核病流行的关键措施。

MTB培养是结核病诊断的"金标准"，但受样本含菌量及培养周期影响，不利于早期快速诊断。临床上结核病患者中细菌学阳性的患者不超过40%，其余患者诊断主要依靠临床表现、影像学改变和对抗结核药物治疗的应答反应。因此，无论结核病的预防还是治疗，均迫切需要更敏感和更特异的诊断技术^[11,12]。例如美国GEN-PROBE公司AMPLIFIED MTD检测试剂盒、线性探针耐多药检测（HAIN）、T-SPOT.TB、GeneXpert、基因芯片，给临床诊断结核病带来了更多的辅助手段。

在本研究中，T-SPOT.TB与其他3种方法比较，阳性率最高。采用抗酸涂片进行检查，阳性率为9.6%，该方法经济、快速、简便，但阳性检出率较低。结核培养的阳性检出率为14.8%，该方法作为目前诊断结核的金标准，常规培养需要1~2个月的时间，采集样本中细菌的数量对阳性率有很大的影响，并且对痰直接涂片阴性肺结核、无痰肺结核、儿童结核及肺外结核应用价值不高，因而不利于早期诊断和早期治疗^[10,13]。现在各大实验室常用的检测方法抗酸涂片及MTB培养可能会对临床诊断结核病造成一定的影响，延误患者病情，使患者不能得到及时的治疗。MTB DNA检测阳性率为20.8%，但PCR方法本身存在很多的影响因素。T-SPOT.TB阳性率为43.3%，该法快速、简便、灵敏度和特异度较高，但试剂盒价格较昂贵，对检测人员及实验条件要求高，对有效普及造成一定困难。目前该方法还不能区分活动性与潜伏性结核感染，判断是否活动性结核，需要临床医生结合临床症状进行，需要进一步去探讨并解决这些问题^[14]。

应用T-SPOT.TB与抗酸涂片、MTB培养和MTB DNA检测结果一致性较低，这与谢希等^[15]和Jones等^[16]的研究结果一致。值得注意的是本研究中有19例MTB培养阳性患者T-SPOT.TB检测阴性，分析可能与MTB强感染的机体免疫功能低下，ESAT-6和CFP-10不足以激起有效的细胞免疫有关，仍需进一步的论证研究^[17]，同时也提醒各位实验室工作人员在今后的工作中需要加强与临床的联系，做好临床服务工作。

检测的一致性评价结果还显示：抗酸涂片与MTB培养和MTB DNA的一致性中等。MTB培养与MTB DNA的一致性中等。建议各实验室在开展结核检测的同时选择多种方法和手段进行，尽可能早的得到病原学依据，为临床医生进行治疗提供依据，为患者的及早康复带来希望。

总之，T-SPOT.TB作为阳性检出率较高的免疫学检测方法，其检测所采用的MTB特异性抗原为MTB RD1区基因编码抗原多肽。由于RD1基因在卡介苗和绝大多数非MTB的基因组中是缺失的，理论上可以避免PPD交叉抗原反应，能够较好地区分真性结核感染和卡介苗接种诱导的反应，对于临床诊断结核具有重要意义。尤其在肺外结核等样本不易获取的患者中值得推广。