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国内外权威猴痘病毒Realtime PCR方法综述!

归去来兮 2022-6-13 313人围观 技术

    关于猴痘病毒的基本知识,大家可以回看猴痘病毒,保持关注,不必惊慌! 关于猴痘病毒我觉得除了从事实验动物、野生动物海关检验检疫的人需要关注外,其他的中国百姓看看热闹就行了,不必过度恐慌。本文会分别介绍WHO(世界卫生组织)、WOAH(世界动物卫生组织、CDC(美国疾控中心)和中国疾控中心关于猴痘的核酸检测方法。


一、猴痘病毒的全球流行情况

1.猴痘病毒全球人间流行情况

    根据世界卫生组织WHO的最新数据,从2021.513-6.10全球共有28个国家报告人感染猴痘病例,其中确诊病例1285例,亚洲至今无病例。



2.猴痘病毒全球动物间感染情况

    猴痘病毒本来就是一个人兽共患的病毒,在自然界中天然宿主包括松鼠、树松鼠、冈比亚袋鼠、睡鼠、非人类灵长类动物和其他物种。通过查找WOAH(世界动物卫生组织)最新信息:“迄今为止,没有家养动物(例如猫和狗)受到猴痘病毒感染的证据。也没有关于牲畜感染猴痘病毒的证据或报告。”

二、WHO关于猴痘病毒核酸检测介绍

    WHO 在“Surveillance, case investigation and contact tracing for Monkeypox(Interim guidance)中将realtime PCR和/或测序作为猴痘病毒的确诊方法。

    WHO在“ Laboratory testing for the monkeypox virus (Interim guidance)”中推荐优先使用猴痘病毒特异性realtime PCR或痘病毒通检方法对疑似样本进行检测。

    WHO在文中推荐了三篇文章用于实验室对猴痘病毒进行检测。




三、美国CDC关于猴痘病毒核酸检测介绍

    美国CDC发布了“Non-variola Orthopoxvirus Generic Real-Time PCR Test”和“Monkeypox virus Generic Real-Time PCR Test”两个Real-Time PCR检测程序,关于猴痘病毒核酸检测的流程图如下:


  1. 质量控制

1.1无模板对照(分子生物学等级水)和阳性对照用作检测质量指标,并且必须在每次检测期间运行。

1.2重复可用于确定精密度。如果使用重复,应具有小于3个 CT 值。如果范围超过此值,则检测无效,并重复测定。

1.3每次提取核酸时都应包括提取对照,即人类 DNA。如果提取对照未能用人类 DNA 引物和探针产生阳性结果,则测试是不确定的,必须重复。

1.4不确定的结果或偏差必须记录在实时 PCR 工作表上,并引起实验室主管的注意和审查。

1.5根据制造商包装说明书和/或操作手册在测试前进行设备维护和功能检查。

1.6有关其他质量控制措施,请参阅进行测定的实验室的实验室质量手册。


2.引物探针及反应条件

2.1Non-variola Orthopoxvirus Generic Real-Time PCR Test

2.2Monkeypox virus Generic Real-Time PCR Test


3.判定

3.1Non-variola Orthopoxvirus Generic Real-Time PCR Test

3.2Monkeypox virus Generic Real-Time PCR Test

检出即阳性


四、中国疾控中心关于猴痘病毒核酸检测介绍

    2022年6月6日中国疾病预防控制中心发布了猴痘防控技术指南 (2022 版),附件3为“猴痘病毒实验室检测技术指南

    

  1. 实验室资质要求

    开展猴痘病毒核酸检测的实验室,应当符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》(国务院令第424号)和《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》(卫办医政发〔2010〕194号)有关规定,具备国家卫生健康委备案的生物安全三级(BSL-3)实验室及以上实验室条件,并获得从事猴痘实验活动的批准,具备临床基因扩增检验实验室条件。


2.实验室生物安全要求

    根据《人间传染的病原微生物名录》中的有关规定,猴痘病毒生物危害分类为第一类,是一种高致病性病毒。涉及活病毒的样本灭活操作需在BSL-3及以上实验室的生物安全柜内进行。灭活样本中的病毒DNA提取可在生物安全二级(BSL-2)实验室或PCR检测的专门区域或房间进行,严格按照分区操作原则操作。


3.实验室分区要求

    原则上开展猴痘病毒核酸检测的实验室应当设置以下区域:试剂储存和准备区、标本制备区、扩增和产物分析区。三个区域在物理空间上应完全相互独立,不能有直接空气流通。各区功能分别是:

3.1.试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的制备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

3.2.标本制备区:转运桶开启、标本灭活,核酸提取及加入至扩增反应管等。

3.3.扩增和产物分析区:核酸扩增和产物分析。

根据使用仪器的功能,区域可适当合并。如采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪,标本制备区、扩增和产物分析区可合并。


4.实验室猴痘病毒核酸检测

    实验室接到标本后,应当在BSL-3及以上实验室的生物安全柜内对标本进行清点核对,并对标本进行灭活处理。

    4.1样本:包括痘疱液、病变皮疹、痘痂、全血或血清、咽拭子、皮疹和痘疱表面或渗出液拭子和其它可疑标本。

    4.2提取试剂:组织基因组DNA提取试剂盒或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。

    4.3猴痘病毒检测引物、探针:

    4.4核酸检测:每次PCR反应,除了检测样本外,应加无DNA对照(用水代替DNA)、阳性对照;所有样本,包括对照,应设复孔

    4.5核酸检测结果判断

(1)Real time PCR反应系统的质量控制:反应结果应同时符合以下2个条件,否则试验结果无效,应重新开展检测。阴性对照无扩增,为阴性。阳性对照未出现阴性结果。

(2)结果判定:

A.阴性:双孔Ct>37,或无Ct值;

B.灰区:一孔Ct值>37;

C.阳性:双孔Ct值<37。

所有阳性和处于灰区的样本应重复检测或经序列分析进行确诊。需注意:当样本仅为咽拭子或血清、血浆时,且检测结果为阴性时,应结合临床症状,慎重做出阴性诊断。


    对于一个中国还没有的病毒,国内公众号炒作了一波,IVD厂家纷纷推出产品股票涨了一波,商业炒作完毕后,科学问题终究是要回归科学,大家还是沉下心好好研究检测和质量控制吧!


来自: 原博士带你做检测 | 作者:原博士
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