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PCR实验连续失控!原因竟是这个...

归去来兮 2022-5-24 250人围观 技术


作者 | 肖亮博 陈光炼 李新莲

单位 | 广州开发区医院检验科



前  言


为了保证实验结果的可靠性,每个实验室都会有一套室内质量控制体系,新型冠状病毒核酸检测实验室也不例外。按照《国家卫生健康委办公厅关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》[1]要求,新冠检测实验每批检测至少有1份弱阳性质控品和3份阴性质控品(生理盐水),目的是在于监控实验是否有效以及保证实验的稳定性,从而确保实验结果的质量,为临床提供更加准确、真实的检验结果。


实验的有效性是要求弱阳性质控品在靶基因(ORF1ab、N、E)所在的通道有扩增曲线,并且CT值的上限是在扩增试剂的有效判读范围内,下限是试剂灵敏度的1.5-3倍,内参RNaseP所处通道无扩增曲线(建议使用);阴性质控品靶基因及内参通道无扩增曲线[2]


对于每个检验者来说,最担心的莫过于出现室内质控失控,这不仅说明本次实验结果不可信,还要以最快速度查找出导致失控的原因,采取纠正措施以免影响接下来的实验进程,从而缩短报告审核时间。以下是我们实验室在处理一次失控实验的经历,希望可以跟各位同行一起探讨。


案例经过


由于实验批次较多,以下列举具有代表性的实验相关数据及图表。


相关案例

在新冠核酸检测过程中,在采用B扩增试剂时,质控品连续出现失控现象,如下图1、图2,其中图1出现质控ORF1ab靶标基因弱反应现象;图2出现质控ORF1ab靶标基因无反应。


图1 20220310

图2 20220311


与相关实验操作人员讨论后,初步怀疑失控的可能原因:1.第三方质控开启后放置时间过久?2.提取试剂使用前没有将磁珠充分摇匀?3.质控加样量不足?4.实验工作人员技术操作失误?5.扩增试剂配置后存放时间过久?


寻找原因


1.后连续两日(2022-3-12、2022-3-13)采用B厂家扩增试剂进行实验(笔者操作),使用新配制及原有配制保存的扩增试剂分别进行QC的扩增,以此判断是否为原配制扩增试剂出现状况,然而实验后质控结果令人满意,结果如图3-4。


图3 20220312


图4 20220313


2.2022-3-14采用B厂家扩增试剂进行实验(笔者操作),此批次试验有临床标本及室间质评,实验结果有效,如图5。


图5 20220314


失控再次来袭


在采用第三方质控品QC和室间质评质控品对新配制试剂和保存试剂有效性进行验证,证实两者的结果并没有统计学意义的差异后,使用B扩增试剂再次出现失控现象,第一次实验时出现质控ORF1ab靶标基因无反应,复查时出现质控ORF1ab靶标基因弱反应,如图6-7。


图6 20220315-1


图7 20220315-2


此时,我们再次查找原因并进行排查:1.第三方质控QC开启后放置时间过久?2.提取试剂使用前没有将磁珠充分摇匀?3.质控加样量不足?4.实验工作人员技术操作失误?


再次排查原因


1.采用B厂家扩增试剂进行实验,第一次实验时出现质控ORF1ab靶标基因无反应如图8,复查时整板标本重新提取并将第一次提取的质控提取液进行点样扩增比对,发现三个质控ORF1ab靶标基因均无扩增反应如图9,同时用C厂家扩增试剂进行平行实验,实验结果有效,结果如图10。(其中图8、图9为B试剂,图10为C试剂)


图8 20220318-1


图9 20220318-2


图10 20220318-3


以上是在做新冠实验时使用B试剂时出现质控ORF1ab靶标基因弱反应或无反应的一些失控现象,除此之外,我们还做了一些相关的排查工作,详见案例分析。


案例分析


首先在这里先简单描述下实验室试剂使用的情况:目前我们实验室在使用的有三个不同厂家的扩增试剂,分别使用A、B、C来代表:常规使用的是A试剂,B试剂作为隔离点的其中一种试剂跟A试剂一起搭配使用,C试剂为复查试剂;提取试剂则为厂家A提供的试剂;质控选用第三方的无内标弱阳性质控品。


回溯分析此次事件,发现出现的情况相对比较复杂。为何这么说?在出现问题到完全排除问题大约花了一周左右,而B试剂不是每次实验都会出现失控(重点,亦是造成排查的难点):正常的时候CT值没有过多变化,异常时出现单靶标或是反应曲线出现拐点后上升坡度不够。


在连续两天出现实验结果不理想的状况下,结合值班同事反馈的质控情况,首先对当天配制好的试剂提出质疑,是否配制时出现问题导致实验失败,于是便让其他同事配制新的试剂,让标本制备区内的第二位同事重新提取,并使用新配制的扩增试剂进行复查,此举是为了直接排除人为操作不当及扩增试剂配制不佳所造成的实验失控现象,并能保证及时发放实验报告(由于结果报告有时效性要求,因此有时无法过多的进行一步接一步的实验操作排查),


复查结果:B试剂质控结果在控,报告可发。接着连续几天都由笔者进行B试剂的实验操作,中间还对较早前配制的B试剂进行测试排查,发现所配制试剂均无问题(如图3、图4、图5),实验结果均令人满意。 


我们从B扩增试剂出现失控现象开始,进行失控原因的查找,大致方向如下:


1.扩增试剂:

重新配置新的扩增试剂B,同个批次及不同批次的B试剂,排除因为原有的扩增试剂失效而造成的实验失控现象;


2.实验操作:

规范工作人员的操作步骤,排除因为操作不规范所造成的实验失控现象;同时实验中尽量多的使用B试剂进行实验,从更加规范的操作中去排除一些人为因素或是能注意到其他未曾被发现的细节;


3.仪器:

提取及扩增时选择不同的仪器进行实验,排除因为仪器所造成的实验失控现象;


4.质控品:

开启同批次新盒质控品,排除该盒质控品出现质量问题而造成的实验失控现象;


5.提取试剂:

由于实验室刚好仅有一个批次的扩增试剂,因此与厂家工程师进行沟通,查看其他使用单位是否有反馈此情况出现。


在进行排查的过程中,了解到近期使用的提取试剂磁珠制备工艺发生了改变,很容易摇散,不像以往的磁珠需要使劲摇匀才能混匀,因此最近实验的工作人员节省了这一步骤,而笔者本人的操作仍保持此步骤。


实验室标准操作规程要求磁珠应该是均匀地悬浮在裂解液中。虽然提取仪器在提取时一般都会进行磁珠的混匀,然而有些品牌磁珠比较难振散,这会造成磁珠因沉淀聚集为块状而在液面中分布不均,这种情况会导致磁珠可吸附核酸的表面积减少,磁珠结合效率下降,因此操作前均会习惯将提取试剂中的磁珠用力摇散


为了排除因操作操作不规范而造成实验失控,便告知其他工作人员依旧保留该步骤,继续每天观察实验情况。时间到了2022-3-15,质控又开始出现不稳定现象,此次仅仅在复查的时候连续两次都出现质控ORF1ab靶标基因弱反应或无反应,当天第一批B试剂进行实验的时候质控结果良好。


2022-3-18时笔者再次使用B试剂进行检测时,实验出现了质控单靶标现象(QC有轻微污染,出现了IC反应),此时本人直接否定了由于操作失误和扩增试剂失效导致实验失控,排查范围进一步缩小,把目标转移到提取试剂身上,果断的采用第三种扩增试剂C进行复查。


复查时直接使用第一次实验提取后的提取产物进行点样,随带将B试剂也一同复查,进行相关验证。复查结果如上提供的图形,C扩增试剂质控在控,B扩增试剂仍为单靶(图8-10)。


为何现在才能断定是提取试剂问题呢?其实前面提到,我们平时使用的都是A扩增试剂,仅有进行隔离点检测的时候才使用双试剂,而A试剂在这段时间内一直没有出现过实验失控现象,因此忽略了这一方面问题(或许也是我们经验不足)。


在认定是提取试剂的问题之后,重新查阅了实验室的相关入库及实验记录,发现2022-3-10确实是进行了新批号提取试剂的出库使用(前面也有进行试剂的换批记录检查,但是由于A扩增试剂的相对正常及B扩增试剂偶尔出现问题而排除了此信息,忽略了匹配度的问题[3],且批号验证结果也是符合要求[4])。


虽然使用新批号提取试剂后A试剂的QC情况也有相对的推后,但除了有1-2个CT的推迟外并没有发现实验失控现象,同时提取试剂是A试剂的配套产品,因此认为其匹配度相对高于B扩增试剂。


再次与厂家工程师沟通后,更是进一步抓住了事件的源头,推测导致使用B试剂时QC不稳定的情况一方面可能是新工艺产品稳定性不够,另一方面是忽略了提取试剂和扩增试剂匹配度的问题,毕竟新工艺提取试剂以匹配自家试剂为主(自家产品间的容错率会高一些)。后来为了进一步验证,我们重新购入原有旧工艺提取试剂,于是实验情况得到了改善。


                       

从以上做出比对的图形可以看的出,在新旧工艺的提取试剂的表现上,A扩增试剂在CT值上有相对的推迟外,而推迟的程度在N基因上表现的明显一点;而通过B扩增试剂的实验数据收集,发现出现问题的靶标都是ORF1ab基因。


这两个不同试剂所出现的情况都是不同的靶标片段,那有什么关联呢?其实细心观察的同仁们就会发现,虽然是不同试剂出现的不同靶标问题,可是他们有一个共同点:同处FAM通道,由此猜测,是否不同工艺的提取液或是磁珠对于FAM通道里面的荧光染料或探针发生了相应的干扰?


总  结


PCR实验对操作人员及实验环境要求是比较严谨的,因为实验的特殊性,从实验前的准备到标本的提取再到核酸的扩增都是一环紧扣一环,各种细节交织在一起,才能保证实验结果的有效性。


也正是如此,除非有明显的错误,否则查找原因时整个实验环节是无法重现的,因为核酸检测是分子实验,检测对象是看不见摸不着的,更多的都是依据经验去模拟事件的发生,通过“案件重演”——重复实验来对实验进行回顾和排查分析,从而解决失控的根源。这里就体现出标准操作规程(SOP)及严格执行SOP的重要性,随意更改流程会增加问题的复杂性和查找原因的难度。


连续出现实验失控的现象绝非偶然,只有持续的关注和跟进,才能更好地及时解决问题根源。失控原因查找和分析并没有想象中的复杂,只要有正确的思路、明确的方案,就能很快找到对应的原因,采取有效的措施,为抗疫争取更多的时间。




参考文献:

[1]《国家卫生健康委办公厅关于医疗机构开展新型冠状病毒核酸检测有关要求的通知》

[2]《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》

[3]于河山,任峰,张艺凡.六种新型冠状病毒核酸检测试剂的性能评价及其与核酸提取试剂匹配性分析[J].中华检验医学杂志,2021, 44(9): 841-848.

[4]《CNAS-CL36:医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》



END

来自: 检验医学
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