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关于支原体检测的几种方法,你了解多少?

归去来兮 2022-1-14 760人围观 技术


如何选择正确的方法进行细胞的支原体检测?支原体的检测方法有哪些?目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR 法、扫描电子显微镜法,这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况,选择不同的方法,或几种方法联合使用。


一、培养法   

 


培养法为最为经济可靠的方法,但其实验周期较长,所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。


(一)材料与设备
1. 精氨酸肉汤培养基   按说明称量粉剂,蒸馏水配制, 高压除菌(加20%胎牛血清)。
2. 支原体琼脂培养基   按说明称量粉剂,蒸馏水配制,高压除菌(加20%胎牛血清)。
3. 其他   超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管/皿、37°C 培养箱。


(二)操作步骤
1. 样品的储存。样品取材后,最好尽快进行检测。样品如在24h 以内进行支原体检测, 可储存在2~8℃; 如果超过24h 样品应放置于-20℃ 以下保存。-20℃保存的样品,进行检测时需重新加入到对照培养细胞中,培养72h 后,取上清直接进行接种检测。
2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基(半流体)。
3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中(已冷却至36℃) ,每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基,3 支半流体培养基。
4. 接种6d 后,取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。
5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。记录实验结果。


(三)结果判断
培养结束时,精氨酸肉汤培养基如有支原体生长,则液体颜色改变(粉色或黄色) 。
半流体培养基中如有支原体生长,则出现絮状沉淀



二、荧光指示细胞法 

 

荧光指示细胞法较为快捷,方法简单,但其灵敏度有一定的欠缺, 易造成漏检。


常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱,其激发波长为350nm(紫外激发),发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域,由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%),所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点,即为支原体DNA, 证明该细胞有支原体污染。


(一)材料与设备

1. 荧光显微镜。
2. CO2 培养箱。
3. 无菌小爬片。
4. 无菌培养皿。
5. 不含抗生素的完全培养液。
6. 二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml) 。称取5mg 二苯甲酰胺荧光染料加入100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液中,在室溫下用磁力搅拌30~40min, 使完全溶解,-20℃ 避光保存。
7. 二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述浓缩液,加至100ml 无酚红和碳酸氢钠的Hanks 溶液中,终浓度为0.5μg/ml 。
8. 固定液,即乙酸:甲醇(1 : 3) 溶液为细胞固定液。
9. 封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml,以上三者混匀,调pH 至5.5 。
10.不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液或PBS。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO 细胞。

(二)操作步骤
1. 无菌收集待测细胞上清:悬浮细胞离心后取上清液。
2. VERO 细胞爬片:将小爬片无菌置于小培养皿内,滴加VERO 细胞悬液(细胞浓度约3×104 个/ml) 2~3ml, 置于CO2 培养箱内培养24h 使其贴壁。
3. 制备标本。向6 孔板内滴加待检细胞上清液约1ml, 注意设立对照组(已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液),培养48h 后( VERO 细胞汇合前)将细胞爬片从平皿中取出。
4. 漂洗—将细胞爬片置于培养皿中,用不含酚红、NaHCO3 的Hanks 溶液(或PBS) 漂洗3次。
5. 固定—用乙酸:甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。
6. 漂洗—待固定液自然风干后用去离子水漂洗3 次。
7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。
8. 漂洗—去离子水中漂洗3 次,每次1 ~2min 。
9. 封片,紫外激发,观察。


(三)结果判断
当阴性及阳性对照结果均成立时,结果有效 。
1. 阴性结果 仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。
2. 阳性结果 荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。


(四)小结
1. 严格配制工作液及封片液。
2. 保证作为指示细胞的VERO 细胞没有被支原体污染。
3. 必须同时设立阳性及阴性对照, 注意重复,以排除假阳性和假阴性结果。4. 应全面观察爬片,并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。
5. 可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间,避免出现非特异性染色,如胞浆着色。



三、PCR 法  

 


PCR 法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少,既可做细胞本身,也可做细胞上清的检测,同时可以检测多种支原体的污染,是目前常用的检测手段。但其成本较高,条件要求严格,且有时易出现假阳性或假阴性。弥补的方法是对怀疑的样品要经过3 次PCR 检测,或用培养法检测。

PCR 法是20 世纪80 年代中期建立起来的一种体外DNA 扩增实验,其基本原理是酶促DNA 合成反应,即在DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下,经DNA 聚合酶的作用,使DNA 链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点,但其对实验环境要求严格, 实验成本较高, 有时还会出现假阳性的现象。


(一)材料与设备支原体
PCR 检测试剂盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。


(二)操作步骤
1. 样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d,用无菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待测。
2. 模板的制作。在无菌的条件下, 取细胞培养上清1 00μl 于一无菌的0.5ml塑料离心管内,盖好盖子, 95 ℃ 水浴加热5min 。
3. 打开盖子,向管内加StrataClean Resin 10μl,盖好盖子,旋涡混悬器混合,离心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料离心管中,模板制作完毕, 4℃ 保存。
4. PCR 反应。反应体系的最适条件为10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2,200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶,总反应体系为50μl , 反应用去离子水均需用紫外灯照射。
(1)在0.5ml 塑料离心管中加入35.2μl 去离子水及5μl 10 xTaq 反应缓冲溶液。
(2)依次加入下列成分:0.4μl dNTP (25mmol/L)、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。
(3)加2μl 去离子水,总体积45μl 。
(4)加5μl 已制成的模板到反应体系中。
(5)阳性对照,内对照各5μl 加入到各自的反应体系中。
(6)取1支含有以上反应体系的离心管,加入5μl 去离子水作为阴性对照管。
(7)在反应体系中加入100μl 矿物油。
(8)PCR 程序见下表。


5. 琼脂糖凝胶电泳。PCR 反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后,凝胶成像分析结果。6. 结果分析。该方法为检测支原体的定性方法,在电泳泳道上, Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带, 当被检样品泳道出现明亮条带,且位置在阳性对照和内对照条带位置之间,即可认为该样品被支原体污染 。
有时还会发现一条泳道出现多条,可能是该样品感染2 种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现,则可怀疑有支原体污染,重做该样品。


(三)注意事项PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。注意假阳性、假阴性,有时需多次重复。 


四、扫描电子显微镜法 

 

扫描电子显微镜法:扫描电子显微镜法非常直观、准确,对使用环境要求高,操作复杂,实验周期较长,常作为样品的最后定性检测。

(一)原理
利用电子显微镜的超级放大功能, 直接观察培养细胞中支原体污染情况。

(二)材料与设备
待检测细胞, 0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA 、2.5%的戊二酸、1%锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液( pH7.4 ) ,扫描电镜及相关设备。


( 三)操作步骤
1. 将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。
2. 37°C , CO2 培养箱中培养24h , 取出盖玻片。
3. 以PBS 洗涤3 次。
4 . 以2 .5%戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗涤。
5 .以1%锇酸固定30min, PBS 洗涤。
6 . 乙酸异戊酯脱水。
7. CO2 冰点干燥。
8. 喷金。
9 . 扫描电镜观察,照相。


(四)结果分析


支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎,因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去,是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。


来自: 检验星空
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