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实时荧光PCR:内标定量与外标定量的差异

归去来兮 2021-12-7 285人围观 技术


实时荧光定量PCR中样本的浓度对数值(log 值)与扩增曲线 Ct 值呈线性关系, Ct 值越小,浓度越高。根据所采用的定量数学模型的差别,有外标定量法(外标法)和内标定量法(内标法)两种方法。


外标定量:使用一系列已知浓度外定量标准品(一般4-5个浓度梯度)与待测标本进行测定,通过标准品浓度的 log 值( y )和扩增的 Ct 值( x )间线性比例关系,可得到待测样本浓度值和 Ct 值的关系公式,简单理解即 y=Kx+B ,K 和 B 值需由外标准曲线获取,样本扩增 Ct 值( x )代入公式中即可算出待测样本的浓度值( y )。


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内标定量:此处指已知浓度的标准品(即定量内标,1个浓度)与待测样本在同一管内扩增的方法,内标的浓度 log 值(y内)与 Ct内 有一个关系 K1 ,待测样本的浓度 log 值(y样)与扩增 Ct样 也有一个关系 K2 ,通过设计优化使样本和内标扩增效率一致,即 K1 = K2,则样本浓度 y样 可通过内标的浓度 y内 、两个 Ct内 和 Ct样 间的关系计算出,不同厂家 K 的算法模型有差异,相对复杂。




—      两种方法比较      —


_

外标法

内标法

内标作用

辅助样本定量

• 辅助样本定量

• 同时监控核酸提取和扩增有效性

扩增效率假设

样本=定量标准品

样本=内标

标准品与样本

是否同管扩增

孔间提取效率

差异对结果干扰

较大

孔间扩增效率

差异对结果

干扰

较大

样本定量准确性

依赖于样品和标准品扩增效率是否一致,忽略样本的基质差异

依赖于反应体系的稳定和算法优化

每批实验额外

损耗试剂

4-5人份

优势

• 计算软件设计方便

• 设备系统相对开放

• 无需额外试剂消耗

• 无需参比荧光校正孔间差,测量更精细

•内标法定量更适用于低通量的分子POCT检测

劣势

• 严格上需每次实验都做标准曲线测定,有额外试剂损耗

• 标本的基质差异,及设备偏差带来的孔间差会降低定量准确度

• 对试剂开发,设备及监测体系稳定性要求高

• 需要专门的算法和软件判读

代表商品

试剂

• 雅培Abbott RealTime HBV Assay

• 国产多数品牌 HBV  DNA和 HCV RNA定量试剂

• 丽珠HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA定量试剂

• 罗氏COBAS TaqMan HBV Test, 2.0

• 赛沛Xpert HCV Viral Load


        总结        


内标定量由于开发难度留给了设计者,用户层面结果分析更简单,结果由软件自动判读;因实验无需额外制作标准曲线,每次上机节约4-5人份试剂位,损耗更低,也是未来分子POCT实现定量的最佳方案。


外标定量通过测定一条标准曲线,按统一标准对所有孔样本相对“粗放”地定量,因而更容易适应不同设备系统,设计开发也更简单。两种方法各有优势。


题外话,为防止假阴性,要求每个反应孔中均需设置内标,用于监控样本核酸提取和扩增有效性,此内标在外标法定量体系中,仅作为孔内质控使用,在内标定量体系中,同时兼具定量功能。



参考文献:

[1]李金明. 实时荧光PCR技术 第2版.北京:科学出版社.


 

本文编辑:乐乐高

来自: 基因谷
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