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二代测序技术(next—generation sequencing，NGS)是相对于第一代DNA测序技术而言的新型测序手段。其核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成末端的标志来确定DNA的系列。其最大的优势在于通量高、成本较低、敏感性高，可以同时测定几百万甚至上亿条DNA或者RNA序列，大大加快了全基因组测序的速度，从而极大地降低单个碱基测序的成本。 这完全改变了过去的研究模式，给人类和动植物基因组学、转录组学、宏基因组学研究等方面带来了全新变化，并逐步深入到微生物学研究领域中，从而为感染性疾病的诊断和治疗带来了福利。
一、NGS用于临床病原体鉴定 细菌、病毒和真菌感染的确诊长期以来主要依靠临床微生物实验室的培养结果，但是受培养条件和抗生素使用等影响，培养阳性率较低，尤其是在有基础疾病或免疫抑制状态的人群中。基于NGS筛查病原体，可以不依赖于培养结果，直接从样本中获得病原体的核酸序列信息，再通过生物信息学的方法对得到的序列进行比对分析，依靠其无偏倚、随机的特性不仅可以检测已知病原体的基因组，更可以从头组装未知微生物的基因组，后者对新发病原体感染鉴定发挥重要作用。 2014年NEnglJMed报道了全世界第一篇使用NGS用于脑脊液病原体检测，并最终诊断为钩端螺旋体感染病例的文章。并预测称无偏差的NGS将彻底改变临床实践中检测和鉴定不常见病原体的能力。此后，不断有个案报道， Brown等总结NGS用于不明原因脑炎的病原诊断病例，发现NGS确诊了包括肠道病毒、EB病毒、麻疹病毒、疱疹病 毒、结核杆菌等在内的多种病原体感染病例。 2016年北京协和医院神经内科Yao等17r报道了应用脑脊液NGS诊断李斯特菌脑膜脑炎的研究结果，将NGS的临床应用拓展到中枢神经系统细菌感染的诊断中。 2018年上海华山医院感染科先后报道NGS用于临床病例检测，一例为脑脊液NGS检测到布氏冈比亚锥虫，助力诊断人类非洲锥虫病。另一列病例报道显示NGS在鉴定病原体之余，亦可通过采集不同治疗时间段的样本，半定量反映脑脊液中病原体的载量，进一步协助临床监测疾病进展和治疗效果。 近来已有多项研究报道了NGS在新发或罕见病原体诊断中的优势，如2011年通过NGS研究确认，中国农村地区流行的发热伴血小板减少综合征，是由一种新型布尼亚病毒引起的，这种病毒后来被命名“SVI'S布尼亚病毒”。 2016年，一名28岁的中国人从委内瑞拉回国，出现发热、咽喉痛、结膜充血、面红及皮疹表现，被确诊为输入性寨卡病毒病例，利用高通量测序技术直接对混合尿液标本中寨卡病毒的RNA进行测序，获得寨卡病毒全基因组序列。这是我国首次获得寨卡病毒全基因组序列，也是全球首次直接从尿液中获得该病毒全基因组序列。此外NGS在判断人畜共患感染方面也有很大的优势。 这些研究均表明，NGS在临床感染性疾病的诊断和新病原体的发现中已经取得了令人瞩目的成果，其高通量、低成本、可以从头组装病原体的优势是其他基因检测方法无法比拟的。 二、NGS用于新发传染病、医院感染爆发监测和预防 2014年西非各国埃博拉病毒感染肆虐，Tong等通过 NGS对从几内亚和塞拉利昂收集的81种埃博拉病毒的基因组序列进行了遗传多样性及传播路径分析，证实了埃博拉病毒以特定速率进化，否定以前认为的埃博拉病毒进化速率加快的预测。这些数据也对病毒疫苗的开发和进行有效治疗提供了很大的帮助。 利用NGS对病原进行鉴定和分型，为医院多重耐药病原体感染爆发的监测和预防也提供了很多有价值的信息。此外，多项研究表明，NGS不仅可以确认Sanger测序验证的耐药位点，还有助于检测出抗生素耐药基因出现的新发突变，并且通过进一步的实验确定这些基因是否为导致抗生素耐药模式的原因。 三、NGS有助于加深对病原体毒力情况的了解 通过应用NGS了解病原体的毒力情况，可以加深对于疾病病理机制的认识，并有助于选择更有针对性的抗感染治疗。 总之，随着对基因组信息更深层次的理解，测序技术的进步和生物信息学分析软件的革新,测序技术将在感染性疾病的诊治中发挥重大作用，将在生物医学研究和临床实践中发挥更大的作用。 |
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