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微生物检验中常用的生化反应

笔者苏洛 2018-11-20 01:40 PM 1227人围观 技术

各种细菌所具有的酶系统各不相同,对营养物质的利用能力各异,因而在代谢过程中所产生的合成或分解产物也不同。应用生物化学方法检测细菌的代谢产物,有助于细菌的种、属鉴定。这种利用生化方法来鉴别细菌的试验,统称为细菌的生化试验或生化反应,是识别细菌的重要方法之一。微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。


微生物检验中常用的生化反应有:

(一)糖酵解试验

各种微生物因含有不同的分解糖(醇、苷)类的酶,所以分解糖类的能力各不相同,而且分解相应糖类后形成的终末产物亦随细菌种类而异,有的产酸,有的还可以产生气体,因此可作为鉴别细菌的依据,对肠道杆菌的鉴别尤为常见。可用指示剂及发酵管检验。

试验方法:以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体培养基鲁,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。接种后,置36℃ ±1.0 ℃培养,每天观察结果,检视培养基颜色有无改变(产酸),小倒管中有无气泡,微小气泡亦为产气阳性,若为半固体培养基,则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡,有时还可看出接种菌有无动力,若有动力,培养物可呈弥散生长。


本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力,从而进行各种细菌的鉴别,因而每次试验,常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫、溴百里蓝和An-drade指示剂。


(二)淀粉水解试验

某些细菌可以产生分解淀粉的酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再变蓝色。


试验方法:以18h~24h的纯培养物,涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板(一个平板可分区接种,试验数种培养物)或直接移种于淀粉肉汤中,于36℃ ±1 ℃培养24 h ~48 h,或于20℃培养5d。然后将碘试剂直接滴浸于培养基表面,若为液体培养物,则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果,阳性反应(淀粉被分解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。


淀粉水解系逐步进行的过程,因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间、培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性,以pH7. 2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱,因而以临用时制备为妥。


(三) V-P试验

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸缩合,脱羧成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中的氧氧化为二乙酰,二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-P(+)反应。


1.O'Meara氏法

将试验菌接种于通用培养基,于36 ℃ ±1 ℃培养48 h,培养液1 mL加O‘Meara试剂(加油0.3%肌酸或肌酸酐的40%氢氧化钠水溶液)1mL,摇动试管1min~2min,静置于室温或36 ℃ ±1 ℃恒温箱,若4h内不呈现伊红即判定为阴性。亦有主张在48 ℃-50 ℃水浴放置2h后判定结果者。


2. Barritt氏法

将试验菌接种于通用培养基,于36℃ ±1 ℃培养4 d,取培养液2.5 mL先加入5% α-萘酚纯酒精溶液0.6%mL,再加40%氢氧化钾水溶液0.2mL,摇动2min~5min,阳性菌常立即呈现红色,若无红色出现,静置于室温或36 ℃ ±1 ℃恒温箱,如2h内仍不显现红色可判定为阴性。


3.快速法

将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中,挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环,乳化接种于其中,加入5% a-萘酚3滴, 40%氢氧化钠水溶液2滴,振动后放置5 min,判定结果。不产酸的培养物不能使用。


本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽孢杆菌和葡萄球菌等其他细菌时,通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基甲醇的产生,故应省去或以氯化钠代替。本试验常与甲基红试验一起使用。本试验阳性,甲基红试验阴性,反之亦然。


(四) 甲基红试验

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸,进一步分解中,由于糖代谢的途径不同,可产生乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸等大量酸性产物,可使培养基pH 下降至4.5以下,使甲基红指示剂变红。


试验方法:挑取新的待试纯培养物少许,接种于通用培养基,培养于36 ℃ ±1 ℃或30℃ (以30℃较好) 3d-5d,从第二天起,每日取培养液1 mL,加甲基红指示剂1~2滴,阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色,阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性即可判定结果。


甲基红为酸性指示剂, pH范围为4.4-6.0,其pH为5.0,故在pH5.0以下,随酸度增加而红色增强,在pH5.0以上,则随碱度增加而黄色增强,在pH5.0或上下接近时,可能变色不够明显,此时应延长培养时间,重复试验。


(五)靛基质试验

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合,形成玫瑰吲哚,为红色化合物。


试验方法:将待试纯培养物小量接种于试验培养基管,于36℃ ±1 ℃培养24 h后,取约2 mL培养液,加入Kovacs氏试剂2滴~3滴,轻摇试管,呈红色为阳性;或先加少量乙醚或二甲苯,摇动试管以提取和浓缩靛基质,待其浮于培养液表面后,再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴,在接触面呈红色,即为阳性。


实验证明靛基质试剂可与17种不同的靛基质化合物作用而产生阳性反应,若先用二甲苯或乙醚等进行提取,再加试剂,则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色,因而结果更为可靠。


(六)硝酸盐还原试验

有些细菌具有还原硝酸盐的能力,可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。


1.试验方法

临试前将试剂的A (磺胺酸冰乙酸溶液)和B (a-萘胺乙醇溶液)试液各0.2 mL等量混合,取混合试剂约0.1 mL,加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面,立即或于10 min内呈现红色即为试验阳性,若无红色出现则为阴性。


用a-萘胺进行试验时,阳性红色消退很快,故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。a-萘胺具有致癌性,故使用时应加注意。


2.试验方法

将含有0.02%-0.2%硝酸钾的蛋白胨水分装至试管中,每支试管预先放一个倒置的发酵管,然后在121℃高压灭菌15 min.按肉汤培养基方法接种,连同已灭菌的对照管一起在最佳生长温度培养2d-7d,在接种管和对照管中加上Griess Ilosvay试剂1 mL或亚硝酸盐试纸,几分钟内出现红色表明亚硝酸盐产生。对照管应为微红色或无色。


阴性结果应进行确证。向试管中加入微量锌粉,将残存的硝酸盐还原成亚硝酸盐,出现红色表明有硝酸盐存在;如没有颜色变化,则说明没有硝酸盐存在,硝酸盐已被微生物还原成亚硝酸盐。发酵管中有气体产生表明有氮气生成。


(七)明胶液化试验

有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化。


1.营养明胶培养基

在营养肉汤中加入10% ~15%的明胶,调节pH至7.2, 115℃高压灭菌20 min。


试验方法:挑取18 h-24 h待试菌培养物,以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20℃-22 ℃培养7 d~14d,明胶高层亦可培养于36 ℃ ±1 ℃。每天观察结果,若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后,再观察其是否被细菌液化,如确被液化,即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂,若为阳性, 10 min -20 min后,菌落周围应出现清晰带环,否则为

阴性。


2. Frazier明胶琼脂(改良型)培养基

在营养琼脂中加入0.4%明胶,调节pH至7.2, 115 ℃高压灭菌20 min。


试验方法:在已倒好干燥培养基的平皿上划线接种或点接种。在最佳生长温度下培养2d-14d。使用8mL~10 mL1%盐酸(HCI不像氯化汞溶液那样能很快的产生清晰的沉淀,但本书仍建议使用盐酸,这是为了避免汞盐的毒性及对环境造成的危害)试剂充满培养皿,没有水解的明胶与试剂慢慢形成不透明的白色沉淀,水解的明胶部分呈现了一个清晰的环带。以毫米为单位记录从菌落边缘到环带边缘的清晰带的大小。


(八)尿素酶试验

有些细菌能产生尿素酶,将尿素分解,产生2个分子的氨,使培养基变为碱性,酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶,因为不论底物尿素是否存在,细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.00。


试验方法:挑取18 h-24 h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中,摇匀,于36℃±1℃培养10 min,、60 min和120 min,分别观察结果;或涂布并穿刺接种于琼脂斜面,不要到到达底部,留底部作变色对照。培养2 h、4h和24 h分别观察结果,变为粉红色为阳性,如阴性应继续培养至4d,做最终判定。


(九)氧化酶试验

氧化酶亦即细胞色素氧化酶,

来源: 青岛天泽
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