找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

  • QQ空间
  • 回复
  • 收藏

从咽拭子到报告单—RNA历险记 | 医学科普

归去来兮 2021-10-25 109人围观 杂谈

前言


即时检验(Point-Of-Care testing,POCT),是指在采样现场进行的检验分析手段,由于使用了便携式分析设备,省去了复杂的实验室检验分析环节,可以较为快速的得到结果,而且不一定由专业临床检验人员完成。近些年逐步受到越来越多的关注,尤其是资本市场的关注度。由于新冠病毒的影响,目前POCT在实际的应用是新冠肺炎病毒的快速核酸检测。在其他临床应用中,心脏标志物的POCT可以用于早期心肌梗死的诊断,缩短病人的确诊时间和治疗前的等待时间。此外,在手术室和重症监护室中,POCT可以辅助医生判断病人的凝血功能。节省了标本送检和等待的时间成本。POCT是体外诊断(In Vitro Diagnostic, IVD)产品的一个分支行业,由于便捷快速的特点,针对新冠病毒核酸的快速检测的POCT行业近两年增长迅速。巨大的市场需求,加速了国内IVD企业的进口替代过程。


携带新冠病毒的患者,其口鼻咽的分泌物内会有病毒的存在。通过咽拭子或者鼻咽拭子,检测者可以获取到这些分泌物的样本。那么从获得样本直到最后检测出结果,这些样本会经历那些“历险”呢?

 

首先要从新冠病毒的结构讲起。

 

新型冠状病毒是一种RNA的病毒,和其他病毒一样,RNA病毒由外层的蛋白质外壳和核心的RNA遗传物质组成。

 


提取和检测到RNA的存在,便可以推断出样本中含有病毒,进而做出病毒携带者阳性的判断。

 

那么如何获取RNA呢?

 


首先,拭子在刮取样本后,会被浸泡在保存液中。保存液分为灭活型和非灭活型。其中,病毒在非灭活型的保存液中将会保持活性,因此对于新冠肺炎病毒而言,会导致采样运输和检测过程中的医护人员面临感染风险。因此大多数情况,选择灭活型。但灭活型保存液有破环病毒核酸完整性的可能。总之,获取到样本后,需要裂解液破坏病毒外层蛋白质包膜结构的同时保留内部核酸的完整。

 

高中的生物知识告诉我们,RNA由AGCU四种核苷酸构成,而DNA由AGCT四种核酸构成。DNA可以转录成为RNA。而RNA可以逆转录成为DNA。要知道,病毒的RNA相比DNA之下相对脆弱,容易被破坏。因此,在病毒核酸检测的过程中,需要将病毒的RNA通过人工的方式逆转录为DNA。其中RNA的碱基排列序列和其对应的DNA互补,因此该DNA片段被称作互补DNA(complementary DNA, cDNA)。

 


制备好cDNA之后,就可以通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)对这段DNA片段进行数量上的扩增。借用了DNA半保留复制的特点,以指数倍的增长增加该DNA片段的数量。

 

 

如果样品中包含有病毒核酸序列,那么就需要某种方式把它们显示出来,这个时候就要用到分子的标记手段。在过去,特定的核酸序列需要通过放射性物质或者可以显色的反应进行标记进行检测和量化。

 

不过,随着二代PCR定量检测技术的发明,可以用荧光物质与目标核酸片段进行结合,然后观测反应中的荧光光强,这种方式克服了传统标记的种种劣势,使得量化和检测方式更加方便。每次扩增,荧光信号都会有变化,并且随着时间绘制成曲线,因此,这种检测方式被称为实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time,qPCR),是目前最主流的方法。

 


此外,近几年还出现了第三代的定量分析技术——数字PCR(digital PCR),这种核酸定量分析技术可以借助微流控手段,将核酸分子“数”出来,从而实现了对 DNA 样品的绝对定量,是PCR领的前沿技术及发展方向。但目前在临床应用上仍处于探索阶段。

 

在对样本中的核酸进行检测后,就可以根据检测结果输出检测报告了,最终反馈到医疗机构和受检人的手中。

 

在上述以核酸检测为例子的过程描述中我们可以发现,大致可以分为三个主要步骤:样品的初步处理,PCR扩增,定量分析。而目前市面上不同技术的主要差异在于扩增技术和定量分析技术之间的差异。这些不同的技术方法在进行组合之后便构成了不同的技术路线。 

 

对于定量分析而言,只要可以反映出样品中的含量的方法,理论上都可以用于体外诊断。例如:利用物质反应后的显色现象,可以对样品进行检测,包括胶体金法,酶联免疫法等等;利用物质的放射性,可以通过放射性变化进行检测;利用化学发光,激发荧光或自发光的物质标记,可以通过测定光对样品进行定量检测;利用不同的物理性质,可以区分样品中的不同物质,例如免疫层析法,质谱法,电泳法等等;

 

对于扩增技术而言,除了传统的PCR需要升降温度外,还有目前的恒温扩增技术等。这些技术各有其优缺点,尤其个别技术在传统的实验室中需要耗费大量的时间。此外,分子诊断的样品处理流程需要标准化,环境一致化,操作自动化的特点也促使了整个分子诊断实验需要集成到设备中。 

 

近期,来自芬兰的生物技术公司Abacus Diagnostica、Kaivogen 和 Labrox联合建立了一家IVD公司,目的是开发一种可以同时进行PCR与免疫分析的多功能仪器,用于进一步缩短检测周转时间和提高检验效率,预计在2024年推出新的测试平台。

 

的确,近些年POCT行业发展十分迅速,越来越多更高效的技术创新经过转化不断投入市场,进一步提高了检测效率。在自动化设备的帮助下,样品的初步处理更为标准化。扩增过程中多次的温度升降以及各种加样反应和洗脱过程,以及后续的定量分析,都集成在设备中自动进行。自动化的好处是可以同步处理多个样本,大大缩短了批量处理样本的时间,增加了检测效率。2020年开始,疫情时代的来临,对该领域技术升级的需求也不断增加,出现了一系列的增长机会。

 

值得一提的是,新冠疫情期间,短时间内检测试剂的需求爆发式增加,为了不影响检测的进行,有人创造性地将多人的样品集中检测。既节省了试剂,缓解了试剂短缺的压力,又提高了效率,达到快速全民覆盖。随着国外疫情的反复以及长期与新冠病毒共存的防疫背景下和越来越多疾病快速检测的需求加持下,该行业的发展前景十分广阔。

 

目前,国外分子POCT方向的大型公司有赛沛、罗氏、美艾利尔(雅培)、西门子医疗、Biofire(梅里埃)等大公司。我国POCT行业起步较晚,行业集中度低,企业数量众多,规模普遍较小,大多数企业普遍存在研发投入不足、自主创新能力缺乏,新产品新技术开发慢,核心竞争力弱的情况。此外,由于行业内本身的技术含量较高和使用价值类似产品的企业生产众多,行业内规模化程度较低,质量参差不齐,同质化产品竞争激烈,缺乏产品线丰富、技术优良、市场占有率高的企业。随着个性化医疗,精准医疗,社区医疗等环境的不断成熟,更加小型化便捷化的即时诊断设备助力基层医疗机构的需求也会不断增加。并且在疫情的带动下,无论是POCT行业的上游仪器研发,还是原材料供应,笔者认为是国内相关企业发挥国内制造优势,走上国际舞台,加快进口替代的的难得机遇。

 

图片来源:

https://pixabay.com/

Molecular Architecture of the SARS-CoV-2 Virus. Cell. 2020 Oct 29;183(3):730-738.e13. doi: 10.1016/j.cell.2020.09.018.

https://www.youtube.com/watch?v=yNflu1illCo

 

来自: 思宇医械观察 | 作者:医疗忍者
我有话说......