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同济经验-核酸提取方法对新冠核酸检测结果的影响

归去来兮 2021-10-13 44人围观 技术


用于PCR反应的核酸模板质量是影响新冠核酸检测的重要因素,涉及核酸回收率、纯度、完整性等多个参数。不同核酸提取系统在核酸提取原理(如柱提取法、磁珠提取法、裂解法)、上样量、洗脱体积等方面存在差异,导致PCR反应结果差异。目前,市售核酸提取系统种类繁多,其提取效能比较的数据相对缺乏。


我们对A(A1、A2型)、B两个厂家三种核酸提取仪的核酸提取效果进行了比较。三种核酸提取仪均为开放平台,本实验采用相同的第三方试剂进行提取和扩增(相同的扩增仪)。两个厂家均采用磁珠法提取核酸,操作遵循厂家说明:A厂家使用200ul标本,洗脱液80ul,取5ul处理后的标本核酸作为PCR模板,B厂家使用100ul标本,提取的核酸全部(无洗脱)加入PCR反应体系进行扩增,所用PCR扩增试剂阳性判断Ct值为40,待评估标本分别为室间质评物(高载量)和临床标本(高、低载量)(表1、2)。


表1

不同核酸提取仪

对相对高病毒载量标本(Ct值27~37)核酸检测结果的比较


表2

不同核酸提取仪

对低病毒载量标本(Ct值36~40)核酸检测结果的比较

注:背景为黄色的测试代表一个厂家或者两个厂家结果阳性。


结果显示,对于高病毒载量的室间质评物,B厂家较A厂家提取的核酸的N基因Ct值低约5~6个循环;同样,对于高病毒载量的临床标本,B厂家较A厂家提取核酸的N基因Ct值低约2个循环;A厂家两种核酸提取仪(A1、A2)提取核酸ORF1ab基因扩增Ct值分别为36.65、36.05,N基因扩增Ct值相差约1个循环,分别为32.71和31.28(表5)。室间质评物和临床标本经A、B两个厂家提取仪提取的核酸Ct值差值存在差异(N基因:5~6 VS. 2),可能因质评物靶样构成(为噬菌体病毒样颗粒)和基质成分与临床标本不同,具体原因有待进一步研究。


此外,我们于2020年3月14日留取21例新冠住院患者咽拭子标本(入院时新冠核酸阳性,此次采样送检目的为住院期间病毒监测,病毒核酸阳性与否及病毒载量高低不确定)和42例非新冠病人咽拭子标本用于比较两个厂家核酸提取仪的核酸提取效果,结果发现:


在新冠患者中,A厂家提取仪提取核酸的阳性检出率为38.10%(8/21),高于B厂家提取仪(28.57%[6/21])(A、B产品均阳性4例,A阳B阴4例,A阴B阳2例), 差异有统计学意义(P<0.05),检出阳性标本N基因Ct值位于36~40之间,为低病毒载量。余11例标本(PJ9-PJ21)经A厂家提取仪提取核酸检测N基因或ORF1ab基因有特异性PCR扩增曲线(无Ct值或Ct值>40),而B厂家提取仪提取核酸无扩增曲线(表6)。42例非新冠病人标本经两个厂家三种仪器提取核酸均未检出阳性结果,亦无扩增曲线(结果未展示)。


两个厂家仪器对低病毒载量标本提取效果不一致的原因可能为:B厂家仪器提取的核酸不纯,或含有PCR干扰物质(未洗脱,含磁珠),对低病毒载量标本PCR扩增反应具有更强的抑制作用,进而出现假阴性结果。


值得注意的是,采用临床标本进行评估时,N基因的Ct值明显低于ORF1ab基因,这可能是由于ORF1ab或N基因之间的相对扩增差异,因为N基因的亚基因组mRNA水平相对ORF1ab基因高得多[1]。


上述结果显示,不同厂家的核酸提取仪提取效果存在差异。因此,在新的核酸提取仪应用于临床实践之前应评估其核酸提取效果。另外,用于评估的标本除定值标准品之外,还应包含高、低病毒载量的临床标本。


“同济经验,敬请指正!”



参考文献:

1.Moreno, J.L., et al., Identification of a coronavirus transcription enhancer. J Virol, 2008. 82(8): p. 3882-93.

来自: TJ检验快讯 | 作者:同济医院检验科
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