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免疫检验专题 | 抗核抗体检测和结果解读的再认识

归去来兮 2021-8-12 348人围观 医学

文章整理自福建医科大学附属协和医院检验科主任曹颖平教授专题讲座的内容
本文将从抗核抗体的意义,抗核抗体的检测方法和临床意义,抗原抗体检测流程,抗原抗体结果报告和解读四大部分,深入探讨关于“抗核抗体检测和结果解读的再认识”的内容。

一.抗核抗体的意义

抗核抗体(ANA)又称抗核酸抗原抗体,传统意义上是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称。但随着检测技术的改进,以及培养细胞抗原机基质(如HEp-2)的应用,ANA针对的靶抗原成分已由细胞核扩展到整个细胞成分,包括细胞核、细胞浆、细胞骨架及细胞分裂周期蛋白等。所以目前ANA的定义是以真核细胞的各种成分为靶抗原的自身抗体总称。
在细胞的所有抗原成分当中,有一部分抗原可以用生理盐水从胸腺、脾脏、细胞中提取出来,这部分抗原就被称为可提取核抗原(ENA),常见的有RNP/Sm,Sm,SSA,SSB,Scl-70,Jo-1等。针对ENA的抗体,则称它为ENA抗体。
随着抗原抗体定义的改变,其临床意义覆盖范围也有所扩展。从原来主要针对系统性的自身性免疫疾病,即通常所说的风湿性疾病,到现在也针对一些非系统性的,器官特异性的自身性免疫疾病,当然也包含一些其他的疾病,比如感染,肿瘤等等,同时也包含一部分正常人群。

二.抗核抗体的检测方法和临床意义

随着技术发展,抗原抗体的检测手段也越来越丰富,其中,间接荧光法应用最多,也是抗原抗体检测的“金标准”,因为其不但可以反映阴阳性,还可以反映滴度、核型。但是荧光检测的一大难点是检测判读的准确性,因此为了提高其准确性,应在荧光片设计的时候考虑不同机制的组合进行提高。有条件的实验室,可以联合HEp-2细胞核猴肝基质来提高检测的准确性。比如抗核膜型的抗体在猴肝当中有点形的菌状荧光;线粒体抗体在猴肝中呈颗粒样,整个视野呈现细沙状荧光等,这些具有特征性的荧光片设计,都能够为更好地确定靶抗原带来帮助。而通过核型的确定,可以针对性的检测对应靶抗原的,具有特异性的自身抗体,从而指向并确诊相对应的自身免疫性疾病。
另一种常用检测方法是免疫印迹法,它的特点是:一个实验膜条包括15种高特异性纯化抗原,能同时检测出多种系统性的自身性免疫疾病。
以下是抗核抗体检测在五种常见自身性免疫疾病中的应用经验:

1、系统性红斑狼疮(SLE)

系统性红斑狼疮是一类较容易误诊的致死性疾病,对于它的最新诊断标准,无论是欧洲风湿病学会,还是美国风湿病学会,入围的标准都必须是抗原抗体阳性,Hep2≥1:80,同时还有免疫学的标准,例如抗磷脂抗体,高特异性抗体,且至少出现一个临床标准。

像是dsDNA、Sm、核糖体P蛋白、PCNA都是系统性红斑狼疮SLE的标志抗体,如果同时出现核小体呈阳性,则常常提示伴有狼疮肾炎的SLE;如果同时出现组蛋白呈阳性,则常常提示药物诱导性的SLE。

2、混合性结缔组织病(MCTD)

混合性结缔组织病的特点是:血清中有高滴度ANA和nRNP抗体。所以对于混合性结缔组织病的诊断,不管是哪一套检测标准,里面都必须包含血清学的标准。

高滴度ANA的nRNP抗体,是混合性结缔组织病的特征标志,阳性率达到95%-100%,而且抗体的滴度与疾病的活动程度相关。然而nRNP抗体也可以出现在SLE的患者当中,并总伴有Sm抗体的阳性。因此,对nRNP抗体和Sm抗体结合的情况,应注意结果的解释。如果nRNP抗体和Sm抗体结果同时为阴性,那么则表示无血清学证据表明患者患有系统性的自身性免疫疾病;如果结果同时为阳性,则表示患有SLE的可能性比较大;如果混合部分为阳性,单独部分为阴性的话,则表示患有MCTD的可能性比较大,但是也不能排除患有SLE的可能,因此还要进行SLE的其他特征性抗体检测加以排除;如果混合部分为阴性,单独部分为阳性,则表示结果不可信,应采用其他方法进行进一步验证。

3、干燥综合征(SS)

干燥综合征是一种外分泌腺受累的自身免疫性疾病,对于它的诊断标准来说,同样要有自身抗体的阳性。而关于SS的指标,一般SS-A(Ro)阳性率在40%-95%,会提供干燥综合征、新生儿SLE、SLE的临床意义;SS-B(La)阳性率在40%-95%,会提供干燥综合征、SLE的临床意义;Ro-52阳性率在81%,会提供多种结缔组织病的临床意义。其中由于Ro-52的特异性比较低,所以现在大多数临床医生建议不再采用Ro-52的结果。

4、系统性硬化症(SSc)

系统性硬化症以往的诊断标准敏感性和特异性都比较低,特别是对于早期的系统性硬化症和局限性的皮肤型系统性硬化症诊断缺乏敏感性,因此极容易导致漏诊和误诊,从而导致患者病情的进一步进展。

所以在2013年,由美国风湿病协会(ACR)和欧洲抗风湿联盟(EULAR)组成的联合委员会,共同制定了系统性硬化症分类标准,其中增加了一项免疫医学的标准,相比以前具有更高的敏感性和特异性。

在SSc的特异性指标里,如果出现Scl-70呈阳性,则表示弥散型进行性系统性硬化症,且常常提示预后不良;如出现抗着丝点抗体呈阳性,则表示局限型进行性系统性硬化症,且常常提示预后良好;如出现PM-Scl抗体,则表示多肌炎与硬化症的重叠综合症,或单独的多肌炎。

5、多肌炎/皮肌炎(PM/DM)

多肌炎/皮肌炎是皮肤与肌肉受累的自身免疫性疾病,它的指标常是PM-Sd和Jo-1,前者常提示多肌炎与硬化症的重叠综合症或单独的多肌炎,而后者常提示多肌炎/皮肌炎,对于多肌炎具有更高的特异性,同时也是病情严重的标志物。

除了间接免疫光法和免疫印迹法,越来越多的实验室采用ELISA、化学发光、流式荧光的方法来进行抗原抗体的检测。而纵观ANA常见的检测方法,也已经有了从定性到定量,从手工/半自动到全自动,从低检测通量到高检测通量的转变,但是在敏感性和特异性方面还存在差异,因此还需要更多的临床实践验证。

三.抗原抗体检测流程

如前所述,抗原抗体的检测方法很多,在利用这些方法前,首先要通过试剂的说明书来了解该方法的适用范围,同时还要了解该方法的局限性,特别是其灵敏度和特异性。如果能实现平行检测的话,就可以实现不同的方法相互验证,起到互补的作用;但这又无疑会增加患者的负担,并且对于医保飞行检查来说,可能会被认为是不合理或不规范的。因此每个实验室需要根据自身的情况,结合方法学的特点,来制定相对合理的检测流程。
关于抗原抗体的检测策略通过以下三部分展开:

1、da-DNA。其检测方法也很多,包含放免法,间接免疫荧光法和酶联免疫法。各种方法本身存在不同,且阳性率也不同,存在着交叉重叠的情况;而且由于抗原来源、抗原包被形式,以及实验体系反应条件不同,不同实验方法的结果不能进行直接比较。但是鉴于联合检测可以提升阳性率,所以专家建议采用“定量+特异性”的方法结合检测。

2、自动化和智能化。国内采用的检测方法主要是间接免疫荧光法,免疫印迹法和酶联免疫吸附法,而随着智能化和自动化的发展,渐渐发展到了欧美国家较为主流的方法,即流式荧光法和化学发光法。但是无论是采取哪种方法,都要结合实验室的自身特点以及方法学的自身特点,制定一个相对合理的检测流程。


3、滴度测定。很多临床医生都希望,不管检验科采取何种检验方式,都能够提供滴度信息,但是作为检验科,应更多地根据实际情况来决定是否要提供滴度信息,而不是一味地迎合临床。因为在《抗核抗体检测的临床应用专家共识》里中有提到:ANA滴度与疾病活动度相关性很低。因此并不推荐使用滴度变化值来反映疾病的活动性和疗效反应性。

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除了检测流程的合理性,合规性也是不容忽视。特别是今年的医保飞行检查,更是其提出了更高要求。因此在制定流程时,要有充分的依据,深入阅读试剂的说明书以及相应的指南和共识,同时还要保证与临床的沟通,并通过大数据来证明该检测项目及流程的合理性,以及对疾病诊疗的贡献。

例如大多数实验室的检查流程一般为:当患者疑似有自免疾病时,会进行一个抗原抗体总检测(间接免疫荧光检测法),而当总抗原抗体检测呈阳性时,要再进行特异性抗体确认实验(印迹法),这时的确认实验如呈阳性,则要结合临床症状进行诊断;确认结果如呈阴性,则要对患者进行跟踪监测,同时增加特异性抗体的检测项目。但此处需要注意的是,对于高度怀疑的疑似患有自免疾病的患者,无论他(她)的抗原抗体总检测结果如何,都要再对其进行一个特异性抗体确认实验。如果有条件的话,可以同时检测Hep2细胞和猴肝细胞的核型,以减少漏诊情况。

四.抗原抗体结果报告和解读

随着对专家共识、指南解读的不断加深,以及和临床交流的不断加强,结果报告也逐渐开始规范起来。现在相对来说比较规范的抗原抗体检测单,一般会包含抗原抗体阴阳性、滴度、核型,以及抗原抗体呈阳性后DNA抗体组的分析等等,除此之外,也会根据一些试剂的情况来增加一些临床所需要的建议。
检测时所使用的间接免疫荧光法因其高灵敏度,成为检测ANA的标准方法,通过该方法不但可反映阴阳性,还可以确定ANA的滴度和核型,对于疾病的诊断和进一步特异性抗体的检测来说,具有很重要的提示和针对性。因此,抗核抗体检测的临床应用专家共识里就有提到:ⅡF-ANA检测结果报告中应包括检测方法、定性结果(阳性/阴性)、荧光模型、滴度及必要的临床建议。对于混合荧光模型,荧光模型的报告优先级顺序为细胞核荧光模型、细胞浆荧光模型、细胞有丝分裂期荧光模型。相同优先级的荧光模型,建议按滴度高低顺序依次报告。
而当实际结果出现一些特殊或者矛盾的情况时,也应该能为临床提供有效咨询。例如:

01

间接免疫荧光方法呈阳性,而印迹法阴性时,很有可能是因为Hep-2细胞含有100-150种抗原,而LA方法只有高特异性的15种待定抗原,这种抗原就可能未包被在膜条上,所以ⅡF阳性,而LA阴性。像是这种情况下,我们要增加其他特异性的抗体检测来进行核实。

02

间接免疫荧光法阴性,而印迹法阳性,这种情况很有可能是印迹法呈弱阳性/假阳性,或是因为其他非自身性免疫疾病所引起,再或是由于方法灵敏度的差异,总之在这种情况下,需要制定相应的复检来进行复核。

03

ANA阳性,但无相应的临床症状。一般来说,只要ANA检测阳性,则说明存在自身抗体,而高滴度ANA高度则提示自身免疫性疾病。其实这种情况也分为几种可能性:

(1)健康人群的ANA。5%-30%的健康人群ANA弱阳性,特别是以女性为主。健康人群中的ANA,常见核型为核颗粒型,大于70岁的老年人或者孕妇的ANA阳性最高。(2)其他疾病。例如感染、血液病、内分泌疾病、肿瘤等。(3)疾病早期。据文献报道,在临床症状出现前9.4年,即可检测到自身抗体,因此在这种情况下,需要对患者进行连续的观察和检测。(4)药物诱导。现已知有超过80种药物可能诱导ANA产生,而通常停药后,ANA就会逐渐消失。

04

ANA阴性,SSA强阳性。这种情况结果更多见于非自身免疫性疾病患者,如感染、甲状腺功能异常等患者。

综合以上所述,对于抗原抗体的检测来説,如检测结果阳性,那么就需要从患者年龄、性别,用药史,荧光染色模式,滴度信息,自免病的疑似程度等多个方面考虑。
最后,只有不断学习相关“指南”和“共识”,充分与临床进行沟通,提高临床实验室对ANA检测的临床应用范围、临床意义和结果解读等方面的认识水平和能力;通过选择合理的ANA检测方法,来制定符合所在医院规定的检测流程,规范结果报告,最终才能为临床提供既经济又有价值的抗核抗体检测报告。


来自: MIR医学仪器与试剂
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