免疫组织化学石蜡技术指南——样品准备篇

免疫组织化学简介

免疫组织化学 (IHC) 是确定组织切片上是否存在蛋白及其位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法或 ELISA 等免疫测定方法低，但它能了解整个组织的情况。适用于癌症等疾病发展及治疗情况的评估。因此，从 IHC 获得的信息结合显微技术提供了一副“宏图”，使来自其它方法的数据有据可依。

免疫组织化学染色是抗体识别目标抗原的过程。抗体具有高度特异性，只与组织切片上相应的蛋白抗原结合。应用显色检测法即能显示抗原-抗体反应，一种显色方法是酶结合抗体作为底物，在蛋白抗原位点产生色素沉着，另一种方法是荧光检测法，即将荧光染料结合到抗体上，应用荧光显微技术检测。

在进行染色前，需要将样本制作成石蜡切片或冰冻切片。以石蜡切片为例，样品的准备过程可以分为两个阶段：

第一阶段

第一阶段包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋六步

1）取材

根据不同标本的情况，确定最佳取材的大小。若是动物组织，一般推荐2cm x 2cm x 0.2cm。

2）固定

正确的固定是免疫组织化学法的关键。最常用的是 10% 中性甲醛溶液 (NBF)。Abcam 说明书推荐 IHC-P 使用该固定剂，另有说明的除外。其它不常用的固定剂还有多聚甲醛 (PFA) 或 Bouin's 液（甲醛/苦味酸）等。

理想的固定时间取决于组织切块的大小和类型。对于大多数组织来说，通常固定时间在 18-24 小时之间较为理想。固定不足可能导致组织切片边缘有染色信号强，中间无信号。固定过度将会屏蔽抗原表位。虽然抗原修复有助于克服屏蔽作用，但如果固定时间太长（比如一周）那么抗原修复也无济于事。

3）脱水和透明

脱水的目的是将材料中的水分脱掉。常用的是一定浓度梯度的乙醇对材料进行脱水。透明的目的是让组织中的脱水剂被透明剂所代替,使石蜡顺利地渗入组织中,增强组织的折光系数。常用的透明剂是二甲苯。

4）浸蜡和包埋

将透明后的材料放入溶解状态的普通石蜡中，让材料里含有石蜡，以便包埋时与包埋蜡融成为一体。将溶解状态的包埋蜡倒入蜡槽中,然后把浸蜡后材料取出迅速放入蜡槽底部(注意材料大小与方向) ，最后将蜡槽置于冷水中制成蜡块。

第二阶段

第二阶段经过切片、贴片、脱蜡、水化、抗原修复后可以进行正式的染色步骤。

1）切片和贴片

用切片机将蜡块切成理想厚度（依据组织一般大约在 5-20 微米）的切片，然后将切片附着在玻片上。组织切片最好封固在正电荷吸附或 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES) 包被的玻片上，室温过夜。如果切片不能很好的附着在玻片上，可以将其与玻片共同置于 60 °C 孵育1-2个小时。

2）脱蜡和水化

染色前，切片必须先脱蜡至水。如果脱蜡不彻底，会使切片不易着色。

3）抗原修复

大多数甲醛固定的组织在染色前都需要先修复抗原，这是由于在固定过程中产生了亚甲基桥使蛋白之间交联，屏蔽了抗原位点。两种常用的抗原修复方法为热修复法（称之为热诱导抗原表位修复或 HIER）和酶解法。