找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

  • QQ空间
  • 回复
  • 收藏

自建MALDI-TOF MS微生物鉴定数据库专家共识

面气灵 2019-11-27 11:11 AM 1425人围观 医学



自20世纪80年代末开始,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF MS)技术以其对微生物种属鉴定的快速、准确、低成本优势,逐步在临床微生物鉴定领域得到广泛认可。该技术对微生物鉴定的理论基础是将设备采集的未知样品图谱与数据库中已知菌种的图谱进行统计学聚类分析,获得鉴定结果,故此菌种鉴定准确性和特异性高度依赖于MALDI-TOF MS生产厂商或用户预先建立的微生物MALDI-TOF MS图谱数据库的完善性与可靠性。

 

虽然不同厂家均随设备提供了完善的微生物种属鉴定用数据库,但其内容和应用目的往往较为单一,随着用户对MALDI-TOF MS设备的熟悉和深入功能开发,其使用方向和鉴定对象均会出现多样化需求,针对不在商业化数据库范围内,但具有相应临床意义且具有地域分布特征的病原菌,实验时应及时建立和完善微生物指纹图谱数据库。

 

为推进我国抗感染管理的规范化进程,提高对MALDI-TOF MS的全面了解、认识及运用,国内微生物检验学相关领域专家参照《中国临床微生物质谱应用专家共识(2016)》,结合长期临床MALDI-TOF MS使用经验,特编撰《自建MALDI-TOF MS微生物鉴定数据库专家共识》(以下简称"共识")。

 

一、概述


(一)共识目的和定位

MALDI-TOFMS是一种新兴的软电离质谱,该技术打破了传统质谱只能检测小相对分子质量物质的局限性,使得微生物来源的生物大分子进入质谱检测时代。MALDI-TOF MS技术凭借其快速、准确、灵敏、自动化、高通量的特点,为临床微生物实验室添加了新的技术手段,使用过程中逐渐得到技术专家的认可,并有望大幅替代常规病原体生化鉴定方法[1]

 

微生物鉴定数据库是MALDI-TOF MS技术的核心部分,待检测微生物只有与数据库中已有图谱达成高度匹配才能得到准确鉴定结果。截至目前,市场上仅有3个商业数据库供临床检验部门参考使用[2,3],对同一微生物,不同数据库给出的鉴定结果可能会有所差异。近年来,欧美发达国家致力于完善MALDI-TOF MS商业数据库,如梅奥诊所定制的MALDI-TOF MS数据库目前已经囊括1 599个质谱词目,部分微生物数据未纳入商业数据库[2]

 

目前市场上的商业数据库可以满足临床实验室常见微生物的鉴定需求,但数据库中的菌种只代表微生物世界中极小部分[4,5],为完善实验室内部质量控制手段、提高不同目的鉴定需求的成功率,用户需及时建立和完善本地常用、常见微生物图谱数据库。实验室自建微生物MALDI-TOF MS数据库的重要性可体现在:(1)临床工作过程中会不断发现新的菌种。例如,分枝杆菌2009年前只有63个种和亚种,2016年种和亚种达到192个[4],但到目前为止,仍有部分分枝杆菌未纳入商业数据库,这些数据的缺失,不能保障新菌种的准确鉴定。(2)商业化菌种库往往是使用企业收集的有限菌种建立,而临床分离微生物分布、流行存在明显地域性差异,使用者迫切需要应用本地鉴定明确特征微生物建立数据库,甚至将多地区数据库联网共享提高鉴定成功率[3]。(3)除在种属水平识别微生物外,对种属内不同亚型微生物的识别也是不同临床微生物实验室的迫切需求。近年研究发现,同一种属内不同微生物的质谱特征峰存在显著差异,但各设备生产商并未提供满足种属内精细识别分型的数据库,这就要求MALDI-TOF MS使用者在工作过程中根据需要自行建立种属内不同亚型微生物识别的数据库[3]

 

多项研究表明数据库的有效完善可以提高鉴定准确率。随着科研深入,MALDI-TOF MS鉴定数据库不断更新,其鉴定效能会逐渐提高,临床价值会更加突出[6],助力临床微生物实验室能力的提高。

 

《中国临床微生物质谱应用专家共识》[7]中已经提及本地MALDI-TOF MS图谱的建立及质量控制,虽然依据上述共识实验室开展自建库工作在技术理论上可行,但具体流程及操作还有诸多事项需要规范。本专家共识旨在对拟开展MALDI-TOF MS自建库工作的实验室,从操作流程、操作方法及注意事项等方面给出详细建议,供各微生物实验室参考。本共识可帮助实验室开展本地微生物数据库的建立工作,扩大MALDI-TOF MS在微生物鉴定领域的应用范围,提高实验室微生物鉴定的综合能力。

 

(二)共识受众和适用范围

共识受众:配备MALDI-TOF MS的微生物实验室,实验人员已熟练掌握MALDI-TOF MS对常规菌株的鉴定,并在工作中分离到一定数量现有商业MALDI-TOF MS数据库不能准确鉴定的微生物。实验室管理者计划进一步提升实验室人员综合素质、微生物鉴定效能及科研能力情况下,可选择性开展。

 

适用范围:在临床微生物实验室内,针对MALDI-TOF MS商业数据库不能给出准确鉴定的微生物属、种、亚种或特定生物型开展图谱数据库建立。

 

(三)MALDI-TOF MS原理介绍

MALDI-TOFMS主要包含MALDI离子化和飞行时间质量分析器两部分。其原理为:微生物样本裂解后,其蛋白与小分子基质溶液充分混合,待溶剂挥发后形成共结晶,在激光辐射下,基质吸收能量,将电荷转移给样本分子,形成离子化样本,离子化样本在电场作用下飞过飞行管道,根据离子质荷比(m/z)与离子飞行时间成正比的原理,不同质量离子因到达检测器的时间差异而被检测,形成不同的质量图谱。由于不同微生物蛋白组成存在一定差异,将设备采集的未知样品图谱与数据库中已知菌种的图谱进行统计学聚类分析,可获得未知样本的鉴定结果。

 

二、开展MALDI-TOF MS自建库的实验条件


(一)实验室条件准备

首先,拟开展自建库工作的实验室必须符合《临床微生物实验室建设基本要求专家共识》中对实验室环境设备、人员资质、相关检验技术、质量服务等基本要求,其次还需准备如下材料:(1)配备获得CFDA注册证的微生物质谱检测系统及相关耗材,并进行仪器校准,目前国产质谱品牌较多,而进口质谱则以VITEK MS系统和IVD MALDI Biotyper系统为主。(2)待建库菌种准备:可以使用来源可靠的标准菌株,如使用临床分离菌种,须经生化和分子方法精准鉴定,以保证所建数据库的可靠性。验证菌种准备:数据库验证用菌种应使用标准菌种或经其他参比方法鉴定并获得良好结果的临床分离菌种。(3)试剂与标准品:除非有特殊说明,仅使用色谱纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。试剂包括甲酸、乙腈、乙醇、三氟乙酸、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(光谱纯)、2,5-二羟基苯甲酸(光谱纯)、标准菌株(如大肠埃希菌ATCC8739或ATCC25922等)[8]

 

(二)MALDI-TOF MS图谱分析软件

待入库微生物经MALDI-TOF MS分析后,需使用专业分析软件进行图谱采集、分析和挑选。通常MALDI-TOFMS仪器供应商会提供或建议使用相关的质谱图分析软件。目前,用于微生物质谱鉴定的成熟软件包括:生物梅里埃公司的VITEKMS和SARAMIS、BioNμmerics生物信息分析软件、Bruker Daltonics公司MALDI Biotyper系列的ClinProTools软件、Andromas SAS公司L′automateLT2-Andromas的Andromas软件等[9]

 

(三)参比方法

待入库微生物须经传统形态、生化和分子方法获得精准鉴定结果后方可使用,以确保自建图谱库的数据质量。目前大多数细菌采用生化和16S rRNA基因序列分析,大多数真菌采用显微形态(仅限于霉菌)、生化(仅限于酵母)和ITS2序列分析方法进行精准鉴定[7],而分枝杆菌通常在16S rRNA基础上额外选择其他DNA靶点序列进行分析以区分某些近缘种,如rpoB可更好的区分堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌。对于专业机构提供的标准菌株,以确认为目的可进行适当简化。

 

(四)人员能力要求

质谱操作相关技术人员须经过微生物专业技术、医院感染知识、生物安全等基础培训和质谱相关专业培训[10],需要熟练掌握点靶、基质液使用和不同微生物前处理方法,熟练操作运行仪器并执行相应质控[11],能熟练将结果上传至LIS和(或)AST系统,并了解检测各个环节的注意事项,例如靶板制备完成后,如样品为细菌或酵母菌,需在48h内完成检测;如为分枝杆菌,需在4 h内完成检测;如为曲霉菌等丝状真菌,需立即完成检测[12]

 

三、MALDI-TOF MS自建库实施步骤


MALDI-TOFMS自建库就是实验室内部在开放的菌种质谱数据库中增加新菌种或新菌株的过程,其目是增加鉴定数据库种微生物的种类,提高鉴定效能。目前MALDI-TOF MS数据库可分为参考质谱数据库和超级质谱数据库,其中参考质谱数据库是使用标准菌株、临床菌株以及不同条件培养菌株(如不同培养基、不同温度、生长环境等)的MALDI-TOF MS图谱建立;超级质谱数据库是在参考质谱数据库基础上,保留同一种属建库菌株共有的质谱峰,也就是种属特异性峰。

 

(一)自建库考察因素

根据待建库在科研、临床及公共卫生等方面使用目的决定建库内容。建库时通常应考量以下因素:(1)拟建库用微生物流行病学特点;(2)微生物感染后导致相关疾病的严重程度;(3)微生物导致的感染性疾病早期鉴定、治疗与预后关系;(4)微生物同源性分析的意义;(5)现有鉴定方法的不足,如鉴定耗时长、准确率低、过程繁琐、生物安全隐患等;(6)临床和管理部门对微生物实验室报告的需求。

 

(二)建库菌株选择

1.菌株数量:

鉴于MALDI-TOF MS对菌种鉴定是基于图谱聚类原理,建库用菌株的数量与成功鉴定率成正比[13]。建议每个微生物种属选取包括至少一株模式菌株在内的不少于10株具有代表性的菌种建立超级谱图,对首次建库的罕见菌种,至少应包括2株菌,其中一株必须是模式菌株,且需要获得来自不同培养条件(如不同培养基、培养时间等)的谱图至少8张[13],并逐步将数据库完善至来自10株菌的40张谱图。

 

2.菌株来源:

建库用菌株来源应具有代表性和可追溯性,首选由国内或国际菌种保藏机构保藏的、遗传学特性得到确认的菌株[14],并应获取供应商的合格证、检测报告或说明书。其次可选取经生化和分子方法鉴定明确的分离菌株,为增强代表性,菌株最好来自不同地域、不同人群。对于疑难菌种,建议进行全基因组测序来确定其分类学地位。

 

(三)图谱数据采集

1.培养条件:

培养条件不同会引起微生物体内生物大分子发生变化,进而引起对应的图谱信息发生变化。建库时应规范培养条件,以获得高质量、可重复的谱图。不同培养温度会影响菌株的表型特征,同一菌株,高温范围(32~37 ℃)肽质量谱非常相似,而低温范围(22~26 ℃)的肽质量谱会有较大差异[15]

 

微生物培养时间对图谱峰的数量和强度有重要影响,为保证自建库数据信息的可靠性,需要采集同一菌株早期菌落和成熟菌落的图谱建库[16]。具体建议如下:(1)革兰阴性细菌:使用TSAB和MAC培养基,培养时间16~24h和48~72 h;(2)革兰阳性细菌:使用TSAB和TSA培养基,培养时间16~24h和48~72 h;(3)酵母样真菌:使用TSAB和SDA培养基,培养时间16~24h和48~72 h;(4)霉菌:使用SDA和PDA培养基,培养时间2~3 d和7~8 d(快生长),7~8 d和21~25d(慢生长);(5)分枝杆菌:使用Lowenstein-Jensen培养基和Middlebrook 7H10琼脂,培养时间3~5 d和5~7 d(快生长),7~8 d和25~28d(慢生长)。

 

2.前处理方法:

对于细胞壁薄,较容易裂解的革兰阴性菌和部分革兰阳性菌,可直接挑取菌落涂抹于靶点上,覆盖基质,室温下形成共结晶后上机检测。如遇到细胞壁较厚的细菌和真菌,上述方法难以获得高质量的图谱,需要对样本进行前处理,常用方法如下:(1)改良直涂法:加1 μl 70%甲酸辅助破壁后再加基质。此法适用于鉴定肠杆菌科、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、奈瑟菌属、耶尔森菌属及弧菌属等[17]。(2)甲酸-乙腈提取法[18,19]:适用于大多数细菌、酵母菌,尤其黏液型、干燥型菌落。鉴于该方法使用有机溶剂,结合离心、萃取、干燥等步骤,耗时长,建议仅在必要时采用。(3)研磨-超声裂解提取法[17,18,20]:适用于丝状真菌、分枝杆菌、奴卡菌等常规方法难以破壁的微生物。该方法是基于甲酸-乙腈提取法,只是在加入乙酸后,使用微型玻璃珠研磨和超声震荡手段进行裂解。注:不同非选择性培养基对大多数菌种蛋白表达谱无特异性,不影响菌种MALDI-TOF MS鉴定。但应注意避免菌体蛋白制备过程中混杂培养基成分,使用液体和半固体培养基培养的菌株,需经PBS洗涤离心后点靶[7]

 

3.图谱采集:

首先应使用标准品对仪器进行校准后,方可采集拟建库菌株样本的图谱[20]。每个建库菌株进行不少于3个靶点的平行测试[7],从每个靶点获得多张原始谱图后,从中选出质量最佳的原始图谱,每个菌株收集不少于24张有效谱图[7]

 

(1)图谱采集方式的选择:图谱的采集方式有自动和手动两种模式,自动采样是在一致性参数下进行图谱数据采集,速度快、无需人员看守,采用统一的采样路径、激光强度和谱图叠加次数进行图谱采集。建议对于大批量菌株首先采用自动采样,对于低质量的样本点,采用手动模式进行数据补采。如果建库菌株数量有限,则尽量手动采样,以保证获得理想谱图用于建库。

 

(2)谱图优劣判断标准:谱图优劣判断参数应包括:峰数目、S/N比值、分辨率、基线光滑度和信号强度。优质谱图的特征如下[18]:a.主次峰分明,峰分布错落有致,分辨率(m/Am)达800~1 200,峰呈细长形;b.基线平滑、主峰S/N大于2 000;c.主峰信号强度适当(1 000~10 000);d.峰数目较多(100~200)[11]

 

(3)筛选特征峰及权重赋值:在选取的所有图谱中,经过聚类分析,图谱间的相似性应>65%,从中筛选出40~70个共同的特征性峰,使得每个峰至少80%的图谱拥有,通过软件对保留的共同特征峰和所有图谱进行比较,以确定每个波峰的权重值。特征性峰的权重之和不大于权重值上限x特征峰数量,而和非建库菌匹配数权重之和一般不大于该值的40%。

 

(4)图谱库建立:根据峰的特异性、强度、m/z值等综合参数,创建一张包含所有特征性峰的超级图谱文件,建立超级图谱的原始图谱要符合以下条件:a.图谱基线低;b.峰值数量在100~200之间;c.一般保留35~49个峰,每种峰至少在70%~80%的菌株中出现。

 

四、质量控制和验证方法


(一)建库过程的质量控制

实验室需按照MALDI-TOF MS制造商的推荐和相关管理指南制定质控程序。按照制造商要求评估质量分析器、相关系统(软件和数据库)、化学试剂、靶板和用户的操作(靶板点样、有条件时萃取)。

1.仪器校准:

(1)校准仪器是准确鉴定的基础:每批菌种检测前均需用校准试剂进行质量校正,以保证准确性[16,18]

 

2.室内质量控制:

每日标本检测前对阳性对照(质控菌株)进行检测,评价和监测仪器是否处于正常工作状态,同时检测阴性对照以排除可能由于试剂污染或重复性靶板清洗不当造成的假阳性[7]

 

3.室间质量评价:

建议定期自行组织与具有自建MALDI-TOF MS微生物鉴定数据库能力实验室同类检测方法的方法学比对[12,21]

 

4.校准和质控失败处理:

校准失败后,应从各个环节分析原因并予以纠正,常见原因包括:质控菌株/蛋白标准品污染、使用错误的质控菌株/蛋白标准品、使用错误的试剂、操作失误等。如果未发现上述明显的原因可重复测定质控菌株/蛋白标准品,如结果在质控范围,可直接进行后续检测;若还是不能纠正,应联系制造商采取相应的措施[7]

 

(二)自建数据库有效性验证

实验室使用自建库用于微生物的鉴定和报告,属于LDT。LDT是实验室自行研发、验证和使用的检测项目,仅在研发实验室内部使用,不作为商品出售给其他实验室、医院及个人。作为临床实验室开展LDT,可参照相关技术指南中建议的模式在项目研发、项目投入临床检测前确认、项目投入临床检测后的质量监管流程做好LDT质量管理[22]

 

实验室自建库完成后,需要对数据库的有效性进行验证,选取经过鉴定确认的、非数据库中的菌株至少30株[15,19,23,24],在建库菌株相同的条件下,每株重复点靶3次,获得总计90张图谱上传至软件,如果验证菌株数量大,无需重复点靶。与自建库进行模式匹配,分析获得的鉴定结果,来评价自建库的临床鉴定能力。自建库的鉴定符合率应不低于90%[16,23,24]

 

商业数据库扩展后的验证要求较高,通常使用交叉验证法,如使用5倍交叉验证方法,来估计扩展知识库的性能。将整个数据库(包括新增图谱)分成5组,其中一个作为测试组,其他用作参考组,来自测试组的建库菌株谱图通过与来自4个参考组的谱图进行比较而进行鉴定。5个组分别做为测试组,重复该过程5次。5轮的识别结果用于评估性能。正确识别包括:(1)鉴定为单一的目标菌种(高分辨力),(2)除鉴定为目标菌种外,还被鉴定为相近菌种(低分辨力)[25]

 

1.重复性验证:

选择10株标准菌株/经过参考方法鉴定的临床菌株,每天重复检测3次,连续3天。符合率应为100%[12]

 

2.准确性验证:

常见病原微生物进行准确性验证时,每种至少30株;厌氧菌、苛氧菌、分枝杆菌、丝状真菌每种至少10株[12]。如果菌株少见,允许将有限数量的菌株重复检测,如果极端罕见,允许对1种菌株进行30次重复检测,但最好对至少3种独立菌株进行各自的重复性检测,获得至少30个检测结果[5],比较质谱鉴定结果与参考方法(分子生物学)之间的符合率[12],应为100%。

 

3.特异性验证:

在对新建菌的数据库进行验证时,应同时考虑到数据库的特异性,即该数据库不会把非在库的其他近缘菌种鉴定成该细菌。可选择10株经过参比方法验证,同属不同种的细菌对该自建库进行验证,应不会获得任何鉴定结果,特异性为100%。

 

如未满足上述验证要求,需从菌株数量、数据库采集操作标准化、菌株培养条件、前处理条件等方面查找原因,采取相应措施进行修正,修正后的检测系统应再次进行验证[12]

五、局限性


生物学局限性可参照《MALDI-TOF MS在临床微生物鉴定中的标准化操作专家共识》,自建方法有以下局限性。

1. 由于质谱质量检测范围(2~20)限制、数据库的缺乏等因素,对于微生物耐药性的检测仍在探索中[26]


2. 质谱分型方法的操作流程尚未标准化。不同研究团队所采用的细菌培养条件、蛋白样品制备方法、仪器的参数设置各有不同,导致不同实验室间的结果难以重复,质谱结果的解读也没有统一标准[27]


3. 一些研究中使用的分析软件,如ClinProTools等,需要另外购买,临床型质谱仪并没有配置这一软件,这也在一定程度上限制了质谱分型方法的使用[27]



4. 质谱鉴定的准确性依赖于菌种数据库的质量,菌种数据库信息不全将会限制鉴定准确性,丰富菌种数据库将有利于鉴定结果的准确性[27]


六、自建库应用于临床诊断的要求


1.自建库和IVD数据库:

IVD认证的数据库并不允许随意添加数据[5]。IVD数据库在商业化之前是需要通过CFDA的认证,认证过程复杂繁琐,要求很高。对于完成自建库工作的实验室,临床鉴定微生物时,首先应使用原有IVD商业数据库进行结果报告,如出现多个鉴定结果或无鉴定结果时,再采用自建库进行报告结果,自建库和IVD数据库独立分开使用。自建库仅限于在实验室内使用,不得在市场上销售,不得转移到其他实验室使用[28]

 

2.临床诊断报告要求和流程:

实验室使用自建库进行病原微生物鉴定属于临床实验室自建项目,但是目前国内针对LDT检测报告的要求没有标准化,在现有背景下,使用自建库进行微生物结果报告时需要注意以下几点:(1)报告形式参照目前临床微生物检验实验室采用的商业数据库,例如以置信度为阈值。①置信度>90%的单一结果为优质鉴定结果;②60%~90%且具有多个鉴定结果为低分辨结果(需要补充实验进行分类);③<60%为不能鉴定。再如,以分值为阈值时:①>2分(95分)的结果可以鉴定到种;②1.7至2.0分(90~95分)之间可以鉴定到属(需要补充实验进行分类);③<1.7分(90分)为不能鉴定或可能鉴定到属。(2)对自建库进行编号,在报告结果时需附带数据库编号及版本号。(3)签发报告的医师/技师应至少具有中级职称,具有从事MALDI-TOF MS及临床微生物工作经验。(4)数据库使用半年内,建议标本留样,与临床医生保存密切联系,如发现问题,及时处理。(5)报告异议处理:当出现多个鉴定结果或无鉴定结果时,可进行以下分析[12]:①图谱质量低:需检查菌株和试剂耗材的质量、仪器性能状态以及具体操作环节;②图谱质量较好:应检查样本是否分纯、是否污染或数据库需要进一步补充完善。

 

七、总结

无论自建库还是IVD库,数据库中每一张蛋白指纹谱图都可能影响鉴定结果的准确性。因此,针对自建库的整体过程,质量控制是重中之重,必须对建库菌株使用参比方法(分子生物学测序)进行鉴定,建库前确认菌株的培养条件,确保仪器运转稳定性、试剂有效性等,遵循标准操作流程,并在建库后进行重复性验证、准确性验证。此外,在日常实验室应用中,仍建议以IVD数据库为主,自建库与IVD数据库独立使用。使用自建库进行临床检验报告发放,需要参考针对实验室自建方法的相关规定与要求。



来源: 中华检验医学杂志
我有话说......