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流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识

笔者苏洛 2018-8-29 12:00 AM 1957人围观 技术


概述

淋巴瘤是临床上诊断难度较大的一类疾病,需要综合血液病理学(包括组织和细胞形态学、免疫表型、遗传学和分子生物学)与临床特征才能做出精确诊断。流式细胞学(flow cytometry,FCM)免疫分型作为与免疫组织化学相补的诊断方法,以其快速、客观、定量及多参数分析等独特优势,在淋巴瘤诊断方面发挥着不可替代的作用。为了提高淋巴瘤的诊断和治疗监测水平,规范我国对此类疾病的诊治程序,中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会组织国内相关的流式、血液肿瘤和病理专家经过多次讨论,结合国外已有文献资料和国内临床经验,制订了流式检测技术在淋巴瘤诊断中应用的专家共识。本共识旨在推动流式检测技术在淋巴瘤诊疗中的应用,促进多学科合作在淋巴瘤诊疗中的发展。


由于目前FCM对霍奇金淋巴瘤诊断价值有限,本文内容仅涉及FCM在非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas,NHL)中的应用。



FCM在淋巴瘤诊断中的地位与作用

FCM在淋巴瘤诊断中的作用主要分为三个方面:确定诊断、辅助诊断和微小残留病(minimal residual disease,MRD)检测。


01

可以明确淋巴瘤诊断:

主要见于具有特征表型并常以白血病形式存在的淋巴瘤类型,如急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤(ALL/LBL)、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、毛细胞白血病(HCL)、浆细胞肿瘤(PCN)、T大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)、NK细胞-慢性淋巴增殖性疾病(NK-CLPD)、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)等。


02

作为淋巴瘤辅助诊断:

主要是指免疫表型不具有特异性,或具有特定遗传学异常的淋巴瘤类型,FCM可以作为形态学、遗传学的重要补充,起到辅助诊断的作用,常见的有:边缘区淋巴瘤(MZL)、滤泡淋巴瘤(FL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症(LPL/WM)、Burkitt淋巴瘤(BL)、肝脾T细胞淋巴瘤(HSTCL)、蕈样霉菌病/Sezary综合征、非特指型外周T细胞淋巴瘤(PTCL,NOS)和血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)。FCM在大B细胞淋巴瘤中的诊断作用有限,对于有骨髓或淋巴结等组织/器官受累者有一定的参考价值。


03

MRD监测:

多参数FCM在CLL/SLL的MRD检测中已得到广泛地应用和认可,其次是套细胞淋巴瘤和毛细胞白血病,在其他类型淋巴瘤中的应用则少见报道。虽然PCR技术被认为是监测淋巴瘤MRD最敏感的指标,但随着八色以上FCM的临床应用,同时以10-4作为cut-off值时,FCM和PCR技术可以相互补充。


FCM检测流程与方法

01

样本处理与准备

1
样本来源及制备:

FCM样本主要来源于骨髓、外周血、淋巴结、细针穿刺等细胞学样本和来源于淋巴结、结外器官或组织的新鲜组织学样本以及脑脊液、胸腹水等体液标本。所有样本处理的原则是获得细胞产量最大化的单细胞悬液,同时保持细胞的活性和完整性,防止目标细胞丢失。骨髓、外周血标本为天然单细胞悬液,抽取标本置于抗凝管中(肝素或EDTA),室温保存,尽可能12 h内处理标本。若标本放置时间>12 h,应选择肝素抗凝。组织学样本离体后立即置于磷酸盐缓冲液(PBS)、RPMI 1640培养液等运输介质或用生理盐水浸湿的消毒纱布包裹,在送往实验室的整个过程中需保持其湿度,尽快送检,长途运输建议使用RPMI 1640培养液保存。运输中可加冰袋,但需避免样本与冰袋直接接触。样本应尽量立即处理,将组织沿最大面剖开,肉眼观察标本是否有结节、溶血或坏死。通常部分标本用于组织学诊断,部分标本做流式细胞学及分子病理检测。为了防止肿瘤局灶性分布带来的漏诊,可将样本多点分割,每份厚度2~3 mm,送流式检测的样本应紧邻组织学部分,手动研磨或匀浆机将组织分散成单个核细胞,过滤后进行抗体标记。


2
细胞存活率检测及细胞采集数:

检测前需做细胞存活率评估,通常采用着色DNA的荧光染料(如碘化丙啶和台盼蓝),可穿过死细胞膜进入内部而染色,需要注意的是,这些染料能和固定后的细胞染色,因此细胞存活率检测必须采用未做固定的样本。采集的目的细胞总数应达到5 000个以上,特殊情况也应尽量达到1 500个。


02

NHL免疫表型特点

FCM诊断NHL涉及B细胞、T细胞和NK细胞的相关系列抗体,这些抗体不仅可用于细胞表型检测,还可以对细胞克隆性及细胞功能进行鉴别。只有熟练掌握血细胞发育各个阶段,以及病理和生理情况下可能出现的表型特征(包括细胞大小、颗粒性、胞膜和胞质抗原的表达),才能做到精确诊断。


1
B细胞淋巴瘤:

正常成熟的循环B细胞表达CD19、CD20、CD79b、CD22、FMC7和膜表面免疫球蛋白(surface immunoglobulin,sIg)。sIg的轻链kappa(sIgκ)和lambda(sIgλ)比值在1∶3和3∶1之间。在B细胞的成熟过程中,末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、CD34、CD10等不成熟标志逐渐消失,胞质Ig重链重排时出现CD79a和PAX5表达,CD20在Ig轻链重排时才开始表达,且表达强度逐步增强。正常B细胞成熟过程中抗原的表达增强、减弱或消失多呈渐进性,而肿瘤细胞抗原表达多为均质性增强或减弱。(1)免疫表型特点:大多数成熟B细胞淋巴瘤为表达成熟B细胞标志物(CD19、CD20和CD22等)的单克隆B细胞,某些类型淋巴瘤具有独特的免疫学特征,结合前向散射光(FSC)和CD5、CD10等抗原的表达特征可以对成熟B细胞淋巴瘤进行进一步区分归类。对于大部分小B细胞淋巴瘤,FCM结合遗传学结果可以做出分型诊断,具体可参见中国B细胞慢性淋巴增殖性疾病诊断专家共识(2014年版) ,对于组织样本活检考虑为惰性小B细胞肿瘤伴明显浆细胞分化,并涉及与浆细胞肿瘤鉴别的病例,可行病变部位穿刺及FCM检查,有助于明确淋巴瘤的具体类型。而大B细胞淋巴瘤由于累及部位所限以及样本制备中的细胞破坏,则更多依赖免疫组织化学的方法确诊。常见的成熟B细胞淋巴瘤免疫表型鉴别诊断见图1。(2)克隆性检测:绝大多数成熟B细胞肿瘤限制性表达sIg轻链κ或λ(κ∶λ>3∶1或<1∶3)。检测中如果其他表型正常,但不表达sIg,建议进一步行胞质轻链检测,因后者仍可能出现限制性表达,只有少数成熟B细胞肿瘤可同时有胞膜和胞质的轻链表达缺失现象。几乎所有的浆细胞肿瘤都限制性表达胞质轻链,通过透膜方法检测胞质轻链可以确定克隆性,仅有极少数病例胞质、胞膜可同时表达或缺失轻链。另外生发中心B细胞可以出现膜表面轻链表达下调。


图1 成熟B细胞淋巴瘤的典型免疫表型鉴别诊断流程图


2
T细胞淋巴瘤:

T细胞占外周血淋巴细胞的60%~70%,在胸腺中分化发育,成熟过程中CD34、TdT、CD99和CD1a等抗原消失,出现T细胞受体(TCR)基因重排,并最终与膜CD3形成复合物。αβ和γδT细胞在胸腺发育早期出现分化,绝大多数(>95%)循环中的T细胞为TCRαβ型。γδT细胞主要分布在脾脏红髓、呼吸道和肠道的黏膜和皮下组织内。正常外周血CD4/CD8比值约为2∶1,骨髓中则相反,约为1∶2,正常成熟T细胞表达CD2、CD3、CD5和CD7,表达CD4或CD8,在外周血中CD4、CD8双阳性和CD4、CD8双阴性细胞比例极低。(1)免疫表型特点:以下表型时提示有T细胞淋巴瘤的风险:①CD4∶CD8比值失衡,大于10∶1或小于1∶10;②CD4CD8或CD4CD8比例增高;③泛T抗原表达异常,最常见CD7、CD5、CD2或CD3抗原表达强度减弱或增强;④淋巴细胞群中CD16、CD25、CD56、CD57、CD279等抗原表达增多;⑤伴异常抗原表达(如CD30、CD10、CD20、CD103、CD13和CD33等)。需要注意的是部分样本中由于肿瘤细胞比例较低而被反应性T细胞掩盖,此时可结合某些标志物的减弱或增强,通过多参数设门进行分析判断。由于良性增生的T细胞也会出现某些抗原表达强度改变,因此不能根据单一异常线索直接诊断为淋巴瘤。对于外周T细胞淋巴瘤及淋巴组织增生性疾病的诊断与分型,主要依靠活检、免疫组织化学染色及TCR基因重排检测,单纯靠FCM表型分析能确诊的类型较为有限(图2)。(2)克隆性检测:70%的αβT细胞可以通过FCM检测TCRvβ的24种表位鉴定其克隆性,出现其中1种TCRvβ抗原的显著增高或者24种表位总和的显著减低提示T细胞的克隆性增生。由于某些免疫反应中也会出现T细胞的克隆性增生,即使FCM检测到克隆性T细胞存在,也要结合临床确定其是否为肿瘤性。如有疑虑,可以通过PCR的方法检测TCR基因重排来提高检出的敏感度和特异性。

来源: 中华医学网
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