专访于艳华教授：革新发展40年，PCR技术助力肝炎诊疗开辟新未来 ...

于艳华主任：

肝炎病毒检测方法学的发展历程，是一部从间接指标到直接病毒学证据的演进史。早期，乙肝和丙肝感染的初步诊断主要通过酶免疫分析检测病毒抗原（如乙肝表面抗原HBsAg）和针对这些病毒的特异性抗体，这些检测方法在识别感染者和了解疾病自然史方面发挥了基础性作用。

然而，血清学方法存在一定的局限性。以乙肝为例，HBsAg是感染的标志，但在某些情况下，如急性感染窗口期或者抗病毒治疗产生突变，其检测可能存在挑战。丙肝抗体通常在感染后约4-16周被检测到¹，存在“窗口期”，早期感染可能难以被发现。更重要的是，丙肝抗体在暴露后会终身存在于血清中，仅凭抗体难以区分既往和现症感染。因此，临床迫切需要更具特异性的确认方法以更好地实现早期诊断和疾病状态区分。

直接检测病毒基因组的分子方法，即核酸检测（NAT）成为了新的关键方向，qPCR技术随即脱颖而出。与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度，其定量检测下限通常可低至10 IU/mL。此外，qPCR极大地缩短了诊断窗口期：针对丙肝病毒（HCV）RNA，在感染后约1-2周即可在血液中检测到²，远早于抗体出现的时间。乙肝病毒（HBV）DNA在感染后约30天即可检测到¹，通常比HBsAg出现早。通过缩短诊断窗口期，有助于在患者免疫反应尚未完全建立之前，及早识别急性感染，助力及时干预和遏制疾病传播。

于艳华主任：

qPCR的高灵敏度是指其能够检测并定量样本中极低浓度病毒核酸（如乙肝病毒DNA、丙肝病毒RNA）的能力。与仅在所有循环结束后提供定性或半定量结果的终点PCR不同，qPCR在每个循环后监测荧光信号变化，从而实现实时定量。其检测下限（LoD）大大降低，针对肝炎病毒可低至2.4 IU/mL左右。更重要的是可以区分LoD（以高置信度，如95%，可检测到的最低浓度）和定量下限（LLoQ）。

这种高灵敏度的检测技术对肝炎诊疗产生了多方面关键影响：首先，能显著缩短诊断窗口期，实现早期诊断。其次，高敏qPCR技术对于识别隐匿性感染（OBI）尤为关键。它能发现低水平感染，如HBsAg阴性但乙肝病毒DNA阳性的隐匿性乙肝感染。最后，高灵敏度病毒载量检测是指导治疗方案制定和监测治疗效果的基石。HBV DNA阳性结果是决定启动抗病毒治疗的重要指标。高灵敏HBV DNA检测能够帮助临床及时发现（极）低病毒载量患者，有效减少漏诊。同时通过定期的病毒载量监测，有助于预警病毒学突破，降低耐药风险，改善治疗效果。

凭借上述优势，高敏qPCR检测有助于实现个体化患者管理，更早干预、精准监测，最终改善患者肝脏健康。

于艳华主任：

对于乙肝，由于HBV的生物学特性，目前通常追求“功能性治愈”或“临床治愈”，主要治疗目标是实现病毒复制的长期抑制，理想状态是HBV DNA检测不到。高灵敏度qPCR检测，以低至10 IU/mL的定量检测下限，能够准确地监测并确认极低的病毒载量。尽管HBV可能不会完全清除，但HBV DNA持续检测不到，意味着病毒得到了有效控制，意味着疾病进展风险显著降低，改善患者长期预后。

丙肝临床治愈的标准是实现持续病毒学应答（SVR）。按照治疗方案完成治疗12周后，血液中检测不到HCV RNA。高敏qPCR检测能够精确地确认病毒载量水平，对于判断患者是否达到SVR至关重要。

于艳华主任：

实验室自动化能够从根本上解决传统手工操作的诸多痛点。我院检验科实验室引入了国际创新前沿的全自动分子检测系统，实现自动化和智慧革新，对此感触颇深。实验室自动化带来的不仅仅是检验效率的提升，其更深层的影响在于它形成了一套强大的质量保证机制，通过最大限度地减少操作错误和降低污染风险，确保qPCR结果的持续准确性和可靠性，为肝炎临床诊疗和疾病防控提供更为精准、高效的支持。

首先，自动化流程极大地缩短了样本周转时间（TAT），能够同时处理大量样本，显著提升检测效率，这对于需要快速反馈结果的传染性疾病检测尤为关键。其次，自动化操作最大限度地减少了人为误差，同时以智能化的结果分析，最大化确保检测结果的准确性和可靠性，为临床诊疗提供更为规范、标准化的支持。最后，自动化流程有效减少了污染并优化实验室空间。通过在单个、封闭平台上执行样本提取、PCR准备等多个程序，显著减少了在不同工作站之间手动转移样本时可能发生的交叉污染风险。此外，一体式的自动化解决方案能够代替大量组合式单机设备，进而提高实验室空间利用率，优化检验工作管理。

于艳华主任：

血清HBV RNA作为反映肝细胞内cccDNA转录活性的新型标志物，备受慢性乙肝领域关注。我院研究发现：在1245例HBV DNA阴性乙肝患者中，近一半（50.04%）仍检测到HBV RNA阳性，其中9.96%为高水平阳性。这些HBV RNA阳性患者的HBsAg和HBeAg表达水平随HBV RNA水平升高而升高，尤以HBeAg变化更显著。HBV RNA与HBeAg呈显著高水平正相关（r=0.70），与HBsAg呈显著低水平正相关（r=0.28）。

然而，HBV RNA的临床应用仍面临挑战。HBV RNA缺乏标准化且广泛认可的检测方法。其在反映cccDNA拷贝数和转录活性方面仍有局限，并且与肝癌（HCC）发生发展的确切关系尚待明确。³有研究也发现，目前的血清HBV RNA 检测灵敏度尚不能准确反映肝内cccDNA 的转录复制状态，未来需大样本的前瞻性研究进一步阐明其临床诊断价值及意义。CHB患者血清中的HBV RNA的来源包括全长pgRNA、剪接变异体和3′端截短体等，市面上的HBV RNA试剂测得的可能不是单一的pgRNA，而是多种RNA成分的混合物，这些成分的复杂性使得不同试剂检测到的RNA可能有所不同。

HBcrAg是一种包含HBcAg、HBeAg和p22蛋白质的复合标志物, 与肝内cccDNA水平具有良好相关性，反映肝内cccDNA转录活性。在一些专家共识或指南中，也相继阐述了HBcrAg的临床意义。

HBV RNA有望在评估cccDNA活性、预测治疗应答和HCC风险方面发挥作用。未来需克服检测标准化和临床验证挑战，以期与HBV DNA、HBsAg等传统指标协同，再加上一些其他新的指标如HBcrAg，来构建更全面的乙肝管理体系，助力实现“2030年消除病毒性肝炎”的目标。