【冯仁丰】血清蛋白标准化系列2—什么是CRM470

欧洲共同体参考局（European Community Bureau of Reference ，BCR）发布的参考物质。在上世纪90年代，称为证实的参考物质(certified reference material)，简称为CRM。从2008年起，欧共体参考局将发布的参考物质重新命名为ERM（European Reference Material），强调了是欧洲的参考物质。当今，与临床检验关联的最高级标准参考物质有两个：一个是美国标准和技术研究院（NIST）代表美国发布的标准参考物质（standard reference material），简称为SRM；另一个是欧洲的证实参考物质（原CRM，现ERM，）。和临床检验有关的ERM，最有名的为CRM第470号，即CRM 470，是专门为多种血清蛋白测定用的参考物质。

一、什么是CRM470?

国际临床化学学会（IFCC）的血浆蛋白标准化委员会，于1989年开始制备、确认、和发布了新的国际二级具基质的参考制品。该制品用于14种血浆蛋白的标准化，它们是：前白蛋白（transthyretin、prealbumin）、白蛋白（albumin）、a1-酸性糖蛋白（a1-acid glycoprotein、orosomucoid）、a1-抗胰蛋白酶原（a1-antitrypsin、a1-protease inhibitor）、铜蓝蛋白（ceruloplasmin）、珠蛋白（haptoglobin）、a2-巨球蛋白（a2-macroglobulin）、转铁蛋白（transferrin）、C3、C4、IgG、IgA、IgM、和C反应蛋白（C-reactive protein）。该物质于1993年中期被欧共体参考局（BCR）确认为证实的参考物质（CRM 470）；该制品的一半由美国临床病理学会（CAP）于1994年中期发布为人血清蛋白的参考制品（reference preparation for proteins in human serum，RPPHS）。CRM 470用作二级具基质的参考物质，将值转换给应用校准品和控制品，用于血清蛋白的免疫测定。

二、以往已有众多的特定蛋白标准，为何还要有CRM470？

在40多年前，WHO为了使新建立的检验项目（分析物）有标准物质，建立产生了几个血清蛋白的一级参考物质（见下述）。全球有大量的二级参考物质在应用，它们由专业组织与厂商制备。这些物质用于不同的方法。不幸的是，在40多年前，二级参考物质间的某些蛋白的差异达100％。证据来自质量评估调查，有美国和欧洲的。这个问题原因不清楚，可能是因如何正确使用一级参考物质无明确规定，极其混乱；或因广泛使用的二级物质，确定定值可能依据一级物质的复制品；一级物质有限，不可能无限赠送，因此有的就无法可用；还有，以往的老制品不适宜更现代的检测系统。很明显，临床需要单一的国际一致的参考物质，减少实验室间的变异，特别是要求使用精确的值转换方法，将一级物质的值转换给可用的参考物质。

三、究竟是血清蛋白还是血浆蛋白，似乎有点乱。应该怎么称呼？

从应用上，一个参考物质可以用于血清或血浆。由于多年来制备控制品、校准品或参考物质的方案中，以往的原材料来源习惯采用抗凝的人血浆，重新加入钙离子，使血浆内的纤维蛋白原转换为纤维蛋白，促使采血液凝聚。经离心、过滤后进行血清分装、冻干加工为稳定的蛋白制品。这样的方案可以使蛋白稳定。但是在实际使用中发现，血浆重钙化未完全除尽纤维蛋白原，形成沉淀，随着保存时间的延长，混浊增加。信号对嘈音比的降低、以及伴随在免疫散射和透射比浊测定中精密度的下降是原因。在免疫扩散检测中，参考物的混浊对检测结果没有影响，但是，在进行免疫散射比浊或透射比浊检测时，参考物质、校准品或控制品的混浊将对检测带来影响。因此在现今制备蛋白参考物质时，如CRM 470参考物质的制备，制备方案直接采用供体的血清，加上其他的措施，避免了复溶后具有混浊的问题。所以，在说明该制品时，应该讲是血清蛋白参考物质；在使用中，可以讲是血浆或血清蛋白的参考物质。

四、以往建立的蛋白参考物质有哪些问题？

在40多年前的条件下，科学家们认识和不认识的问题有：

1、需要血清的参考物质。因为是对病人血清的检测，应该建立具有血清为基础（具基质）的参考物质，因此WHO建立的参考物质是人血清的蛋白参考物质，不是纯蛋白。

2、检测蛋白表示浓度的单位。长期以来习惯使用国际单位（IU）。限于我们对某个新的血清蛋白的认识与纯化条件的限制，也知道依靠已有的纯化蛋白对参考血清内的分析物进行定值结果不可靠。因此，人为命名每个分装加工的安瓿内，具有的每个分析物量为某个数量的国际单位（IU）。这个做法很科学，也很有前瞻性眼光。可是，这个做法与从开始对蛋白测定至今，临床都需要使用单位样品体积下蛋白质量（重量）来报告结果的习惯有矛盾。另外，在开始命名国际单位时，对已冻干的参考标准命名为某国际单位，没有考虑到加入水使冻干物复溶后，单位体积内的国际单位成为除不尽的小数，在实际使用中引入的麻烦。以后建立的其他蛋白标准，仍然使用国际单位，但是考虑了这个复溶的问题，修改了国际单位的定义，使之为：每个安瓿复溶后的溶液内为某蛋白的某国际单位。这样的做法，使国际单位定义不严密。

3、IU/ml和g/L间转换因子的依赖性。如果蛋白结构在有效期内的变化，因天然或外部的影响使蛋白解离或凝聚（包括污染）。所以，转换因子取决于检测的时间点，也即：取决于有效性的转换因子有两个后果：一是厂商必须随时检查转换因子，必须不断纠正这些值，如果检测的是不稳定蛋白，结构随时在变化，更是问题；二是进入市场的较晚的厂商会得到其他的转换因子值，和使用相同免疫测定的、但较早进入市场的厂商的转换因子值不同。

转换因子依赖于有效期、依赖于批号、依赖于方法/系统、依赖于蛋白/抗原结构、依赖于抗体组成、依赖于基体效应、依赖于添加剂/防腐剂、依赖于补充的试剂等。而且，批号的改变会引起新的转换因子值。而作为校准品的新批号的参考制品不一定具有与第一批内相同的蛋白性质。

仅在确定的条件下处理蛋白参考制品，才能得到相同结构的蛋白、并具有相同的免疫反应性。通过物理化学技术分析蛋白结构的特性，必须被大家认可和按此进行。稳定性数据必须分析和公布。这些要求应在比较文献中指出。

4、蛋白的物理化学结构未知的后果。应用参考物质最关键的要点是蛋白现存的物理化学结构，而其浓度被表示为IU/ml。这些蛋白的物理化学结构的特性没有被确认，在有效期内也不检查。没有这些基础，可能的抗原决定簇是开放的：抗原与抗体的免疫反应性主要取决于这些决定簇的数量和亲和力。非常多的蛋白结构是不稳定的，会成为无法检测的变性物，造成：① 可用的抗原决定部位数量变异；② 可用的抗原决定部位亲和性变异；③ 在抗原抗体反应时免疫反应性变异；④ 与方法的反向干扰（影响）有关的信号大小的变异（＋/－）；⑤ 与这个信号不同解释有关的检测值结果的变异（＋/－）。归纳起来：检测信号不仅是蛋白浓度的功能，也是蛋白结构的反映。因此，免疫化学的表现是蛋白结构的重要反映，密切有关。没有这些认识上的基础，IU的建立显得软弱无能。

5、免疫技术的局限性。50年前的免疫测定技术只是免疫扩散，因此建立的参考物质只是为这样水平的技术服务的，并没有意识到使用于其他更先进技术的局限性。

6、没有注意参考物质的使用对象和要求。当时的WHO很大方，任何机构或个人都可以向WHO索取，不需要任何费用，使每批标准很快发放用完。再制备新批号标准时，制备标准条件应极其严密，而在当时的条件下，几乎无法使新批号标准可以重现原有批号标准的原貌，加之为新批号定值的方案考虑不周，使各个批号的WHO标准产生了差异。由于上述的多种原因，在美国与欧洲的实验室室间质量评估调查说明，这些蛋白尽管有了WHO的标准，但是，迫切需要建立新的蛋白参考物质。

转载请注明出处

微信公众号：冯仁丰