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基层检验人的折腾式探索-“穷人版”狼疮抗凝物检测

归去来兮 2023-4-18 04:42 PM 445人围观 技术


作者 | 白劲松

单位 | 成都市新都区中医医院检验科



前   言


自去年从武汉同济医院Tony老师处进修后,便与止凝血检测有了不解之缘。当时有幸结识的一群凝血小伙伴,至今还时常畅谈至深夜。在探讨学习的同时,笔者也有了新的苦恼——如何在保持学习激情不灭的同时,用一台凝血设备,撬开我院的止凝血检测之路。在积极申请新项目、新设备的同时,又该如何提高凝血检测的报告质量,如何用有限的设备进行无限的拓展,如何加强与临床的有效沟通并走进临床?


止凝血检测总避不开狼疮抗凝物(Lupus anticoagulant,LA),对于存在LA干扰的标本,凝血常规检测常表现出APTT延长,使用正常混合血浆1:1纠正试验常不被纠正(不除外有低滴度狼疮抗凝物,混合后被稀释而被纠正的情况)。LA的检测原理是当血浆中存在LA时,可竞争性结合磷脂而导致依赖磷脂的凝血时间延长(筛查试验),加入过量磷脂则可纠正延长的凝固时间(确认试验)。


而笔者有些思考和困惑,那么能否通过效仿SCT检测(以硅土为激活物的APTT试验)LA,通过加入自制的磷脂检测APTT,从而来实现穷人版的狼疮抗凝物检测自由呢?能否通过反复冻融的血小板悬液制备磷脂来纠正APTT,以此来证明LA的存在呢?


实验经过


入选标准:

试验组:①APTT单独延长,可明显判断除外抗凝剂干扰及标本质量影响;②基于ACL TOP系列血凝仪的APTT二阶导数曲线呈双相波形;


对照组:①正常混合血浆;②APTT延长,且可明确为抗凝剂(华法林)干扰的。


试验方法:

①制备富血小板悬液:使用献血者辐照血小板悬液血辫,要求PLT>400×109/L,本次使用悬液PLT为968×109/L;


②冻融破坏血小板获得磷脂来源:将富血小板悬液-20℃冰冻,并室温溶解,振荡混匀,如此反复5~6次,最后将富血小板悬液于56℃ 30分钟灭活后(此时PLT为272×109/L),3000r/min离心10分钟,并吸取150uL上清液弃去后振荡混匀备用;


③血小板中和试验:通过反复冻融激活血小板暴露磷脂酰丝氨酸(促凝表面)后的富血小板悬液,与患者乏血小板血浆1:4混合检测APTT。


判定标准:

①血小板中和试验:APTT-PS/APTT-PLT>1.0,判定为阳性,其中APTT-PS为患者乏血小板血浆与正常混合血浆4:1混合后测得,APTT-PLT为使用血小板中和后测得;


②dRVVT标准化比值:LA1/LA2>1.2,判定为阳性,其中dRVVT初筛LA1=dRVVT-S(患者)/dRVVT-S(NPP均值),dRVVT确认LA2=dRVVT-S(患者)/dRVVT-S(NPP均值)。


评价内容:

①比较血小板中和试验与DRVVT法测得的阴阳性符合程度;


②比较APTT凝固曲线双相波形与LA阳性的符合程度。


研究对象



使用研究对象乏血小板血浆与正常混合血浆
4:1混合后测得APTT结果(APTT-PS);及血小板中和试验中研究对象乏血小板血浆与反复冻融获得血小板悬液4:1混合测得APTT结果(APTT-PLT)。



实验分析


实验操作的同时,也发现了一些问题。比如,笔者也制备了正常富血小板血浆检测APTT为36.9S比正常乏血小板混合血浆31.2S仅轻度延长,凝固曲线图也无明显差异;使用LA(+)患者自身富血小板血浆检测APTT并未缩短,可能与血小板数量(LA阳性患者常伴血小板减少)及并未被激活有关;反复冻融3次并未能有效的破坏血小板,故将冻融次数增加到了5-6次;通过反复冻融破坏血小板,可导致血小板内容物如FⅤ等释放,故增加了56℃ 30分钟灭活;为进一步保证制作的磷脂浓度,故在灭活后增加了3000r/min离心10分钟,并吸取150ul上清液弃去后再振荡混匀。


在实验中选择的8份样本,其血小板中和试验与dRVVT法检测LA的阴阳性相符,从LA(+)的两个样本PP-5、PP-6来看,作为定性试验,本试验并不能很好地反映出LA存在的多少,对于存在中等或大量LA的样本时,可采用1:1混合的方式进行验证。


在对PP-5的进一步试验中,采用制备的血小板悬液与患者乏血小板血浆1:1混合的方法检测APTT为33.2S,也提示可完全被纠正。本试验中标准化问题仍是最大的难点,比如血小板悬液的浓度、是选用的4:1还是1:1混合的方式以及APTT-PS/APTT-PLT的判定阈值等问题,仍需进一步研究探讨。


从试验中可以看出加入制备好的富血小板悬液后,除LA阳性样本外,其余样本均表现为不同程度地延长,但APTT-PS/APTT-PLT的判定阈值是以大于1.2或1.0或其他,仍需更多样本量的验证!同时本试验可以进一步优化,比如可收集正常富血小板混合血浆甚至患者自身血小板悬液,但要求PLT>400×109/L,来制备作为磷脂来源的富血小板悬液,以便更易获取!


综合考虑,使用血小板中和试验来验证LA的存在是有效的,对于未开展LA的基层医院,APTT纠正试验仅能提示存在抑制物,却并不能指明就是LA。而本试验虽操作相对繁琐,并不能作为最终LA报告的依据,但其无需特殊设备及耗材,却可有效鉴别LA的存在,可作为LA检测的有效补充。


本实验入选的6个样本,其APTT二阶导数曲线均存在双相波形,然而最终LA的阳性率仅为33.3%(2/6),着实让笔者惊讶,双相波形提示存在LA的特异性竟然如此低。同时观察到dRVVT法的筛选和确证的凝固曲线图均存在双相波形,甚至正常混合血浆检测也存在双相波形,由此便更加深了笔者的困惑!


对于双相波形的存在,有文献认为其原因可能与APTT实验中异常凝血酶生成有关;也有文献认为可能是由CRP、极低密度脂蛋白和Ca2+的复合物引起的;甚至有文献提出了一个关于非典型峰发病机制的潜在假设,即非典型峰可能是通过阻断凝血过程中纤维蛋白原向纤维蛋白的转化而引起的。


dRVVT凝固时间测定的原理是在Ca2+的存在下,蝰蛇毒直接激活Ⅹ因子,通过共同途径生成凝血酶,将纤维蛋白原转化为纤维蛋白,不受接触因子及Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ因子缺乏或抑制物的影响。dRVVT筛选与确认试剂的区别,仅为磷脂浓度的不同,筛选含低浓度磷脂,确认含高浓度磷脂。那是否双相波形的存在,就是生成的凝血酶的量较少,或者是凝血酶的生成速率较缓所致!双相波形存在的意义,尚存在很多疑问!


实验总结


通过本次实验的验证,解开了笔者心目中的部分疑惑。此实验也体现出了基层检验人的无奈,在检测手段受限的同时,该如何去解决问题。而血小板中和试验可有效鉴别LA,可作为穷人版LA的检测手段。但凝块波形分析(CWA)双相波形的价值,还需要继续去深挖。总之,此种瞎折腾式的探索,不失为检验人保持学习激情的一种有效方式。




参考文献

[1]Radhakrishnan K. Platelet neutralization test. Methods Mol Biol. 2013;992:349-51.

[2]Carroll P, Ray M, Just S, Hawson G. A lupus anticoagulant neutralization procedure using the patient's own platelets. Blood Coagul Fibrinolysis. 1994 Aug;5(4):523-7.

[3]Solano C, Zerafa P, Bird R. A study of atypical APTT derivative curves on the ACL TOP coagulation analyser. Int J Lab Hematol. 2011 Feb;33(1):67-78.

[4]Kanouchi K, Narimatsu H, Shirata T, Morikane K. Diagnostic analysis of lupus anticoagulant using clot waveform analysis in activated partial thromboplastin time prolonged cases: A retrospective analysis. Health Sci Rep. 2021 Mar 12;4(2):e258.

[5]Wada H, Shiraki K, Matsumoto T, Ohishi K, Shimpo H, Shimaoka M. Effects of platelet and phospholipids on clot formation activated by a small amount of tissue factor. Thromb Res. 2020 Sep;193:146-153.




END

来源: 检验医学
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