慢性乙型肝炎病毒感染的宿主相关诊断标志物研究进展

乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）感染是一个重要的全球公共卫生问题，具有极高的发病率和死亡率。2017年世界卫生组织报告显示，目前全球约有2.57亿人患有慢性乙型肝炎，2015年有88.7万人死于乙型肝炎病毒感染。我国是慢性HBV感染的高发区，HBV感染的慢性迁延可能发展为肝硬化、肝衰竭甚至肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），HCC作为癌症死亡率排名第4位的疾病，对人类的健康造成巨大威胁。

HBV是一种非细胞毒性病毒，其引起的慢性肝炎，主要是机体免疫系统清除病毒感染的肝细胞而引起的免疫损伤。HBV感染者在抗病毒治疗过程中的免疫应答能力存在差异，探索辅助早期诊断、精确监测疗效的实验室标志物对于控制HBV感染及严重的肝脏损害具有重要意义^[1,2]。

关于慢性HBV感染的实验诊断，目前的许多研究都聚焦在病毒相关的标志物，包括病毒抗原及核酸。缺乏关于监测宿主免疫系统的标志物。然而，与HBV感染相关的因素中，除了病毒本身和环境因素外，宿主免疫功能被认为是控制HBV感染的主要力量。宿主个体特异性被认为对感染后是否慢性化及是否进一步进展为肝硬化或肝癌有重要影响^[3]。本文将系统性介绍与HBV入侵、HBV免疫逃逸、人类白细胞抗原、表观遗传等相关的反映宿主免疫状态及功能的相关分子标志物，对早期评估易感性、预测免疫应答效能、评估疾病进展等具有广阔前景。

HBV感染细胞的首要步骤是与靶细胞表面的受体结合，将其转化为易感细胞，从而启动感染。2012年，Yan等^[4]发现肝细胞中特异性表达的钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/taurocholate CotransportingPolypeptide，NTCP）是HBV和HDV的功能性受体，该成果引起了HBV研究领域的广泛关注和认可。NTCP是第10个溶质转运蛋白（solutecarrier10，SLC10）基因家族成员SLC10A1的编码产物，是一个多重跨膜的糖蛋白分子，其N端在胞外，C端位于胞浆，分子结构反复跨越胞膜9次。NTCP在空间上形成一个朝向胞膜外侧的空隙，是与HBV包膜蛋白结合的关键结构域^[5]。

1．NTCP多态性位点：

NTCP与HBV前S1受体结合区特异性相互作用，介导肝细胞HBV感染^[6]。沉默的NTCP可抑制HBV和HDV感染，而外源性NTCP表达可使不敏感的肝癌细胞易受病毒感染^[4]。NTCP多态性位点可能与不同个体内NTCP蛋白的表达及NTCP蛋白活性的差异有关，进而影响HBV感染和进展。NTCP rs4646285的AA基因型和rs7154439 AA基因型与HBV感染后的免疫恢复呈正相关，这两个位点的纯合突变可能是HBV感染免疫恢复的保护因素。研究表明，rs7154439突变体可能会影响转录因子结合位点，使NTCP蛋白的表达及活性显著下降，减少与HBV结合，从而减少HBV进入肝细胞，最终促进免疫恢复^[7]。

此外，NTCP单核苷酸多态性S267F突变是亚洲人群特有的变异，在东亚人群中频率约为9%。S267F GA或AA型突变体中肝硬化和肝癌的发生率较低。其机制可能是突变体可降低肝细胞内胆汁盐的摄取，从而降低肝内细胞毒性胆汁盐积聚的可能性。这可能降低慢性乙肝患者发生肝内炎症和氧化应激介导的肿瘤的可能性，从而降低发生肝硬化和HCC的风险。因此，S267F变异体可能有助于确定亚洲的慢性HBV患者发展HCC的风险比较低，并且也可能被纳入肝硬化和HCC预测模型用于临床使用^[8]。

NTCP有望成为慢性HBV感染新的分子标志物和治疗靶点，阻断HBV与NTCP的结合是防治HBV感染的新思路^[9]。靶向NTCP的HBV进入抑制剂，可抑制HBV对肝细胞的感染和在肝细胞间的传播，而且因为作用机制新颖，NTCP抑制剂与现有药物没有交叉耐药，故以NTCP为靶标的药物在抗乙肝治疗中有很好的应用前景^[10]。

2．胆固醇7α羟化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1）多态性位点：

CYP7A1基因是脂类代谢的重要基因，位于第8号染色体q11-q12上，其编码的CYP7A1是胆汁酸经典生物合成途径中的限速酶，可分解胆固醇为胆汁酸以维持肝细胞内的脂质稳态。研究发现，HBV结合NTCP后可抑制胆汁酸进入肝细胞，引起CYP7A1表达增高。CYP7A1的升高将促进胆固醇转化为胆汁酸，过量的胆汁酸则会破坏肝细胞，导致肝脏发生不同程度的炎症反应。

CYP7A1基因SNP可影响某些功能的改变，如位于启动子区域的rs3824260位点突变可能影响基因转录效率，其CC基因型可能使CYP7A1表达上调，导致血清总胆固醇水平增高，从而促进肝细胞内胆汁酸的合成和减少胆汁酸的肝外摄取^[11]。当胆汁酸摄取量减少时，可竞争结合胆汁酸受体NTCP的HBV进入肝细胞的数量增多，有助于T细胞识别感染肝细胞，最终实现病毒清除。因此，rs3824260 CC基因型可能作为HBV感染良好恢复的实验室指标。此外，位于内含子上的rs4738687位点突变会影响基因剪接^[12]。与健康人群相比，肝癌患者的rs4738687的突变型GG基因型频率明显降低，提示该位点突变后可能与肝癌的发生发展呈负相关。综上，CYP7A1基因SNP与慢性HBV感染的临床转归有一定的相关性，对预测HBV感染患者的不同临床结局有良好前景。

在慢性HBV感染中，HBV刺激肝细胞产生免疫信号分子诱导固有免疫应答，并通过发挥抗原递呈作用激活机体的获得性免疫。然而，由于肝脏的免疫耐受微环境中高表达的HBsAg或HBeAg，固有免疫和活动性免疫反应都被削弱，HBV特异的T细胞免疫存在功能耗竭或者功能异常^[13]。多种免疫共抑制分子，例如程序性细胞死亡受体1（programmed death-1，PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxicTlymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）、淋巴细胞活性基因3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）、T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3（T cell immunoglobulin and mucin domain-3，Tim-3）等，这些分子在HBV特异的T细胞上均表达上调，其表达与慢性乙肝的感染持续及疾病进展密切相关，可以为寻求新的抗病毒治疗策略提供思路，逐步成为HBV感染新的分子靶点^[14]。

1．PD-1：

PD-1是一种相对分子质量为55 000的糖蛋白，属于CD28家族成员之一。作为免疫系统的负调节因子，它主要在活化的T细胞上表达。PD-1的激活促进CD4+和CD8+T细胞增殖的抑制，这与细胞凋亡和抑制IL-2分泌有关。通过PD-1信号通路影响T细胞在效应后期的反应，因此在持续的抗原暴露后可观察到PD-1表达上调^[15]。PD-1和其配体PD-L1的相互作用可以通过诱导T细胞凋亡或T细胞功能障碍诱导肝脏免疫耐受，限制免疫反应的程度。有研究表明，肝内PD-1和PD-L1阳性细胞的数量与肝炎的程度呈正相关，即PD-1和PD-L1表达水平在炎症发作期显著升高，炎症消退时逐渐降低。

2．CTLA-4：

CTLA-4也属于共刺激分子CD28家族，是另一种在HBV慢性感染期间驱动T细胞衰竭的抑制性受体。其结构与PD-1具有23%的同源性，然而，PD-1是单体，CTLA-4是一个二硫键二聚体^[16]。CTLA-4信号在免疫反应开始时存在于淋巴结的早期阶段，而PD-1信号存在于晚期（在组织部位），以阻断T细胞活性^[17]。也就是说，CTLA-4在T细胞活化时调控免疫反应。

慢性HBV感染患者HBV特异性CD8+T细胞中高表达的CTLA-4与HBV病毒载量呈正相关，CTLA-4的阻断增加了分泌IFN-γ的HBV特异性CD8+T细胞的增殖，提示调节CTLA-4的表达是治疗慢性HBV感染的另一种治疗方法^[18]。

3．Tim-3：

Tim-3免疫球蛋白超家族成员之一，是特异性表达在分化终末期的Th1细胞上的免疫调节分子。Tim-3与其配体galectin-9相互作用可负向调控IFN-γ的产生，并可影响Th1细胞耐受的形成^[19]。相对于未感染的个体，慢性HBV感染患者的CD4+和CD8+T细胞上Tim-3表达上调，并且表达高水平Tim-3的病毒特异性细胞分泌的IFN-γ比Tim-3阴性细胞少。

负性共抑制分子参与了慢性病毒感染宿主中病毒特异性CD8+T细胞功能的免疫调节^[20]，诱导宿主免疫耐受，造成CD8+T细胞的下调^[21]。负性共抑制分子的高表达反映肝脏的免疫耐受微环境，预示病毒的持续复制，HBV感染的慢性化及疾病进展和不良预后。阻断负性分子的激活可以恢复衰竭的病毒特异性CD8+T细胞，从而为治疗慢性乙型肝炎病毒感染提供一种有前景的策略^[22]。

HLA系统是与疾病有明确关系的遗传系统，也是免疫应答的重要基因群，高度多态的HLA Ⅰ和Ⅱ类基因可以影响HLA分子触发免疫反应的能力，从而影响病原体感染的结果^[23]。作为免疫应答组成部分的HLA在HBV感染的免疫应答中起着重要作用^[24]，而高度多态性的HLA基因是与HBV感染相关的生物候选易感性基因，其中HLA-DP和HLA-DQ的多态性是宿主慢性乙肝易感的基因因素。

1．HLA-DP多态性：

HLA-DP区域有高度多态性，该基因簇在T细胞同种识别及抗原肽结合中起关键作用。其多态性可导致抗原提呈能力的变化，最终影响HBV感染的结局。全基因组扫描（genome-wide association study，GWAS）发现，HLA-DP的两个位点rs3077和rs9277535与HBV感染易感性显著相关，rs3077 A基因和rs9277535 A基因可显著降低HBV慢性感染的风险，并显著增加HBV的自发清除。这表明上述两个SNP对于预测HBV持续感染有着良好前景。

2．HLA-DQ多态性：

2011年日本开展的GWAS研究中发现HLA-DQ的两个SNP位点（rs9275572和rs2856718）与HBV感染后的不同结局有关^[25]，rs9275572 A和rs2856718 G为HBV感染的保护性因素，可降低感染HBV的风险，增快HBV自然清除和延缓HCC的进展^[12]。

HLA多态性与乙肝易感性及感染后病毒自发清除有关，同时与HBV感染慢性化相关，影响着免疫应答过程，在HBV感染清除过程中的作用也日益受到重视，对于慢性乙肝的早预防和高应答率治疗评价有着重要意义，可能成为控制慢性HBV感染的新型分子标志物。

表观遗传是在不改变DNA序列的前提下，通过化学修饰调控基因表达的一种遗传方式，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA调控三种类型，这些调节参与了机体的多项生命活动，任何一种调节异常都可能影响基因表达，进而导致多种疾病。其作为新型的疾病生物标志物，为各种疾病的早期诊断、靶向药物治疗和预防提供了新的机会。microRNA（miRNA）是一种约20~24个核苷酸长度的非编码RNA，通过与信使RNA（mRNA）结合来调节基因表达^[26]，与细胞类型和分化状态密切相关，是参与多种疾病发生发展的遗传调节因子。近年来，在慢性HBV感染相关疾病中，miRNA越来越受到关注^[27]。

1．miRNA-122：

miRNA-122在肝脏中特异性表达，是肝细胞中丰度最高的miRNA。miR-122通过cyclinG1/p53通路对病毒复制起调控作用，可作为宿主限制性因子显著抑制HBV病毒复制。低水平的血清miR-122意味着HBV感染的慢性炎症损伤及病毒的持续复制^[28]。同时，血清miR-122水平与肝纤维化的严重程度呈负相关，并且可作为肿瘤抑制基因参与抑制肿瘤生长^{[22, 29]}，因此，miRNA-122对HBV相关肝病的诊断具有潜在的价值。

2．miR-125a-5P：

miR-125家族是目前研究热门的miRNA家族之一，可靶向调节细胞凋亡因子如p53和BAK1^[30]，从而显著抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。miR-125a-5P能够下调HBV S基因的表达从而显著降低HBsAg的分泌，而HBsAg的表达水平与病毒滴度呈负相关，miR-125a-5P这种效应可能会抑制病毒复制。同时，研究证实了HBV相关性肝癌中，miR-125a-5P明显下调^[31]。有助于深入了解HBV感染的机制及相关肝癌的病理生理变化。

有一些miRNA异常表达与HBV相关疾病研究多属单一性研究，还需要更深入的研究得以证实。miRNA-21等通过抑制ATK和MAPK等信号途径参与HBV感染的免疫应答，其水平的升高与细胞增殖及疾病进展相关^[32]。miR-325-3p作为肿瘤抑制因子，通过抑制AQP5从而抑制细胞增殖并诱导凋亡^[33]。在HBV感染后，miR-325-3P的下调导致了一个靶向aqp5的表达增加，这可能在慢性HBV感染和HCC发展中起到重要作用。miRNA-486-5p分别在肝癌组织及细胞中低表达，可能在肝癌发生发展中起负调控作用^[34]，通过和血清miR-122及甲胎蛋白联合诊断可提高肝癌的检出率。综上，miRNA有良好的生物标记物特性，有助于了解HBV感染过程中HBV与宿主相互调控的具体分子机制，为开发出新一代抗病毒复制的药物分子靶标具有良好的应用价值。

外泌体是与细胞质膜融合后释放的细胞外囊泡，大小在30~150 nm之间，是起源于多泡体（multivesicular body，MVB）形成过程中的管腔内囊^[35]。这些囊泡可由多种类型细胞产生，并可在血液、尿液和其他体液中检测到。外泌体含有多种生物大分子、功能蛋白和核酸等，通过在细胞间转移上述物质来介导细胞间联络中发挥作用^[36]。近年有研究表明^[37]，慢性HBV感染患者血清中的外泌体包含HBV核酸和HBV蛋白，并以活跃的方式将HBV转移到肝细胞，即将IFN-α诱导的抗病毒反应从肝非实质细胞传播到HBV感染的肝细胞，从而恢复肝细胞的抗病毒状态。因此，外泌体可能作为HBV、病毒核酸和病毒蛋白的载体，成为细胞外HBV标志物的来源^[38]。

在慢性HBV感染中，长期反复肝损伤伴随肝实质结构的改变，往往导致肝纤维化^[39]，评估肝纤维化的阶段对于评估疾病的进展和预后至关重要。目前，肝活检仍是评估肝病组织学结果的金标准。然而，由于采样误差、操作侵入性和高成本，肝活检临床应用的实用性受限。因此，评估肝纤维化严重程度的无创、经济和简单的指标具有广阔应用前景。

1．天冬氨酸氨基转移酶/血小板比值指数（AST to platelet ratio index，APRI）和纤维化4-指数（fibrosis4 score，FIB-4）：

由于肝活检的局限性，一些非侵入性的生物标志物，如APRⅠ、FIB-4等^[40]，已被应用来评估肝坏死和纤维化，并且作为肝纤维化无创性诊断指标之一，被纳入2015年版慢性乙型肝炎防治指南^[41]。天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和血小板（platelet，PLT）被认为是肝纤维化的独立危险因素，基于上述两个因素建立的APRI模型可用于评估肝纤维化和肝硬化程度。而FIB-4模型除了纳入AST和PLT以外，还将年龄和ALT值计算在内，提高对肝纤维化的诊断性能。APRⅠ、FIB-4与组织学严重程度相关，上述指数的应用可以在不进行侵入性肝活检的情况下，诊断患者的肝纤维化^[42]。

2．平均分布宽度-血小板比率（RDW to platelet ratio，RPR）无创模型：

全血细胞计数是最常见实验室检测项目之一，其中血小板计数和血细胞平均分布宽度（red blood cell distribution width，RDW）纳入该模型中，被认为是慢性HBV感染患者肝纤维化阶段的独立预测因子^[43]。Chen等^[44]提出的RPR模型将PLT和RDW两个指标相结合，对诊断乙肝性肝纤维化具有较高的诊断性能。研究表明，RPR与肝纤维化的分级呈显著正相关，ROC曲线分析得知RPR对肝炎性肝纤维化的诊断性能和检测价值均优于APRI和FIB-4^[12]，说明RPR作为一种常规的、廉价的、易于计算的指标，能以高准确度预测肝纤维化和肝硬化，具有较高的临床价值。

随着对HBV感染靶细胞并引起机体产生免疫应答反应机制的研究不断深入，HBV的实验室诊断不再局限于对病毒基本成分的检出，如传统的"乙肝两对半"、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）定量或病毒核酸，而关注于独特表达于被感染细胞的分子标志物，如HBV入侵受体、HBV免疫逃逸相关的宿主蛋白或HLA等。随着分子技术的发展，编码参与宿主细胞的被感染或免疫应答过程的物质的基因型不断被研究。不同的基因型往往提示着患者HBV感染的慢性化、疾病进展和预后的差异，因此，在HBV感染过程中，宿主细胞相关的诊断标志物，逐步成为HBV感染新的分子靶点，并且在HBV感染的早期诊断、靶向药物治疗和预防等具有良好应用价值。