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恶性肿瘤是威胁人类健康最主要的疾病，早期发现肿瘤是抗肿瘤最有效的方法。研究发现，肿瘤发生的早期就有肿瘤细胞或者肿瘤DNA片段释放到体液中，因此检测体液中的肿瘤循环细胞（circulation tumorcells，CTCs）和循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）有助于肿瘤的早期诊断。CTCs最先由Nowell[1]提出，并由Nowell把其定义为来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并通过入侵组织基质进入血管的肿瘤细胞，是原发灶和转移灶之间的桥梁，对肿瘤的诊断、治疗效果评估、复发转移监测有重要作用[2]。ctDNA是肿瘤细胞释放的游离基因片段，长度在20~200 bp之间，携带有肿瘤细胞基因突变特征。CTCs和ctDNA的各项检测技术发展迅速，因具有无创、可多次取样、特异性较高、代谢周期短等优点，能实时反映肿瘤的变化，逐渐用于医疗领域，但在临床应用中存在的问题需要认真分析。CTCs在血液循环中的量很少，检测容易受到血细胞干扰，因此在检测前需要对CTCs进行富集，以获得较高纯度的CTCs。目前的富集方法主要有两种：基于免疫学和基于生物物理学的富集技术；CTCs的检测方法则有多达40余种，主要包括CTCs计数法、免疫荧光法、基因检测法等，见表1。
免疫学技术主要是免疫磁珠富集法，分阳性富集法和阴性富集法[3]。阳性富集法是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，主要适用于上皮细胞肿瘤（乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌等），最具代表性的是CellSearch CTCs检测方法，制定了相应标准：CTCs的细胞EpCAM+/CK+/CD45-特征标志，CTCs数目与患者预后关系等。阴性富集法是利用磁珠与背景细胞结合（如白细胞），再利用抗CD45或抗CD61抗体除去血液中的聚合细胞和血小板，获得CTCs靶细胞[4]，阴性富集法更适用于研究没有选择性标志物或者难以去除某些结合物的标本。基于生物物理特征的检测技术主要利用CTCs细胞体积、密度、变形能力、电泳特征等生物物理学特性来区别CTCs细胞和白细胞等其他细胞，不需要依赖生物标志物，较好地克服了免疫磁珠法的一些缺陷[5]。基于细胞体积的分离法：一般来说CTCs细胞体积比白细胞体积大[6]，细胞质也是白细胞的两倍[7]。CTCs体积的异质性可能源于细胞的凋亡或者细胞处于不同的细胞代谢周期中，可用于分离CTCs和通过检测对肿瘤进行鉴别或者分期。基于细胞可变性的分离方法：CTCs细胞的可变性大于非肿瘤细胞，其特性有利于分离。常用的密度梯度离心法是依据红细胞、白细胞、肿瘤细胞密度和可变性各不相同，离心获得相应的细胞。密度梯度离心法一般作为CTCs分离的初步方法。基于微过膜分离技术：微过滤膜法的原理是基于CTCs细胞体积大和细胞膜硬度高。此方法最先由Seal用于CTCs的分离[8]，其代表性技术分别是ISET®（Rarecells Diagnostics）和ScreenCell®（ScreenCell）。ISET®在临床研究用得较广，主要是应用于肿瘤细胞转移、非小细胞肺癌等[9]。ScreenCell®主要用于细胞机制、细胞培养和细胞分子测试等研究。用CellSieve™微滤器在每个转移性肿瘤患者（10 ml）血液中平均可以找到56个CTCs[10]，甚至还发现了肿瘤相关的巨噬细胞[11]。培养法在肺癌、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤中都可分离培养出具有肿瘤特性的CTCs[12]，再进行细胞试验，结果具有较强的特异性，但是培养耗时长（14~28 d），不利于临床大量开展。CTCs计数法是基本的检测方法，利用细胞膜表面的特异性分子标志物，进行分离和计数，结果可以显示预后情况[13]。免疫荧光标记检测法主要是用不同的荧光标记物标记不同的细胞，最常用的为CTCs检测判定通用标准的检测方法CellSeach®系统[14]，使用自动荧光显微镜对CK+/DAPI+/CD45-细胞进行计数。此方法特异性高，容易标准化，但由于特异性抗原缺失，容易造成假阴性。包括荧光定量PCR、CTCs基因芯片技术、CTCs基因测序和微流控技术检测。荧光定量PCR：荧光定量PCR是先对富集的CTCs进行裂解，利用PCR相关技术检测血液中游离RNA确认CTCs，可以在（1~10）×106个正常细胞中检测出1个CTCs，但容易出现非特异性RNA产物，造成假阳性。逆转录PCR比PCR更有特异性，可以检测到肿瘤特异性的RNA水平，同时具有高的敏感性，但逆转录PCR容易发生样品污染，一些炎症反应也会分泌CTCs从而造成检测结果假阳性。实时定量荧光PCR和实时定量探针PCR等是近年来出现的新方法，可以利用特异性探针和实时定量联合检测CTCs，提高了扩增的效率和敏感性，具有更高的临床应用价值。CTCs基因芯片技术：在微流体控制技术的原理上开发出的检测技术，主要是基于流体学原理结合抗原抗体反应，捕获样本中的CTCs。该技术已成功在肺癌、胰腺癌、结肠癌患者外周血中检测到了较多数量的CTCs；2010年后研发出可在芯片上进行染色、以鱼骨样矩阵为特点的第二代芯片技术[15]，缩短了抗原抗体反应的时间，大大提高了CTCs的检出率，但是基因芯片技术在临床中应用还需要更多的实践和验证。CTCs基因测序：测序的信息可能含有原发肿瘤中所没有的突变信息，通过比较原发肿瘤和CTCs之间的基因变化也有助于发现基因突变与疾病进展及治疗之间的关系，为恶性肿瘤的诊疗提供帮助。微流控技术检测：是采用微流控芯片在微米和亚微米水平下控制微小流体的技术，可以模拟细胞的相互作用，具有非接触、精度高、组织培养、营养供应和废物清除等优点，以及高通量、反应体积小、需要样本量少，具有对微量的样本完成多种项目的平行分析的特点，使实验中的反应、前处理及检测等流程集成到1个微流控系统中完成，具有较大的发展潜力和应用价值[16,17]。但由于微流控产品通常不是集中在临床实验室使用，其质量控制、重复性、线性和精密度方面还有欠缺，临床检测尚需更多的相关研究。1989年有研究发现肿瘤患者血浆中的游离DNA有一部分来自于肿瘤细胞[18]。ctDNA在外周血含量极少，片段小，容易与血浆蛋白结合，不同肿瘤分离出的DNA的质量和数量变化很大。近年来，越来越多高灵敏度和高特异性的技术应用于ctDNA的检测，使得ctDNA在肿瘤相关研究中得到了很大的应用。目前，ctDNA的检测技术种类很多，主要有PCR技术和二代测序（next-generation sequencing，NGS）为基础的检测技术，见表2。
数字PCR通过实现"单分子模板PCR扩增"，利用阳性反应器确定靶细胞ctDNA的拷贝数。微滴式数字PCR甚至可以检测到0.001%的检测下限[19]。该检测方法的缺点是不能检测未知突变，不适合高浓度DNA样本检测，因此目前数字化PCR技术大多数用于科研工作，仍未能广泛应用于临床。BEAMing技术是数字PCR和流式技术的结合，利用特异性PCR引物与相应的磁珠结合并进行扩增，再利用流式细胞计数探测荧光标记，从而确定突变情况，如可以检测出乳腺癌患者磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α突变、非小细胞肺癌的表皮生长因子受体突变等。该检测方法灵敏性较高，但目前难以发现较小的肿瘤的突变，也不能用于发现新的突变[20,21]。标记扩增深度测序的通量高，测序时间短，一次能测几十万到几百万条DNA分子。其主要原理是针对目标区域设计引物进行15个循环的预扩增，再通过单重PCR选择性扩增带突变的扩增子区，最后在扩增物两端加上测序接头及特异性标签序列进行单端测序。这种技术可以检测肿瘤患者的基因突变，也有利于指导个体化用药，与全基因组测序相比更经济有效，但存在一定的假阳性。深度测序肿瘤个体化分析方法是一种捕获测序技术，利用肿瘤基因突变数据库等来源寻找靶细胞对应的序列，然后对样本进行靶向捕获后再进行深度测试。该技术主要用于检测非小细胞肺癌（non-small-cell lung carcinoma，NSCLC）的ctDNA，对Ⅱ期以上的NSCLC中ctDNA的敏感度为100%，Ⅰ期的敏感度为50%，各期的特异度均有96%[22]。条形码测序技术有较高的保真度，主要通过适配体连接增加条形码序列，从而进行深度测序，再用线性扩增消除PCR中的错误，可以用来鉴别个体分子。该技术降低了PCR扩增中出现错误的概率，但检测通量低，一次只能研究一个核小体因子，需要更多的研究以提高其检测通量以广泛应用于临床。全外显子测序技术（whole exome sequencing，WES）是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后，进行高通量测序的分析方法。外显子测序筛查范围和检出率等方面较其他测序技术具有明显的优势，相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等也具有较大的优势，如比较神经母细胞瘤的组织活检和ctDNA的体细胞突变和基因拷贝数量改变，探讨神经母细胞瘤的肿瘤异质性[23]。其不足之处是只能获得外显子区域内部或边界的变异信息，不能检测到基因组内较大的结构性变异。靶向测序也称目标区域测序，是利用PCR或探针杂交的方法对目标基因组区域进行捕获和富集并进行高通量测序，进行遗传变异位点检测，获得指定目标区域的变异信息。与传统的一代测序、全基因组测序以及全外显子测序相比，目标区域测序能够获得更深的覆盖度和更高的数据准确性，提高了对目标区域的检测效率。与传统的组织活检或影像学技术相比，CTCs和ctDNA具有显著优势，标本来源可以是血液或其他体液，可以进行无创检测。同时在血液或体液中找到CTCs或ctDNA对肿瘤的诊断有更直接的证据，并且可以用来指导治疗和预后评估等。但CTCs或ctDNA的检测有一定局限性，其在血液或体液中的含量很低，尤其是ctDNA。其次，由于肿瘤细胞的异质性，对CTCs和ctDNA技术要求很高，如何提取到高纯度的CTCs和ctDNA也是这两种方法在临床应用中面临的挑战。另外，并非所有肿瘤都会有CTCs或ctDNA进入血液循环或者其他体液中，因此也存在一定的假阴性。CTCs和ctDNA应用于临床诊疗中，需要注意以下几个问题：（1）检测前标本处理流程的标准化。不同检测方法使用不同种类的细胞保护剂，采集后放置时间、离心过程和ctDNA的提取、纯化等均有差异，而这些差异可能影响结果。（2）检测流程的标准化。不同的检测方法或平台对CTCs和ctDNA的标本量、检测通量、检测靶点各不相同，操作流程也有很大差别，造成不同公司间的结果可比性不强，故需要有标准化检测流程，使得检测结果具有可比性。（3）政府完善相关政策和监管机制。目前CTCs和ctDNA在临床中的应用受到一定限制，除了检测技术和平台要求高外，其价格也是备受关注的。不同的方法或平台间的灵敏性和特异性相差甚远，临床诊断性能也各有差别，对结果的可比性和重复性分析造成一定困难。如何在纷繁复杂的检测方法中选择更适合自身研究或者实验室可行的方法，也是医疗工作者需要重点考虑的问题。解决检测技术瓶颈的方法除了大量掌握当前现有的检测技术的各种原理、优缺点以外，更重要的是通过方法学的比较，激发更多的研究思路，进一步改进或者完善相关检测技术，使CTCs和ctDNA在临床中得到更广泛深入的应用。
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原作者: 邓雅文 蔡栋昊 段朝晖
来源: 中华检验医学杂志, 2019,42(1)
