显微镜下的“鬼影”！

自荷兰人列文虎克（Anton van Leeuwenhoek 1632-1725）创制了第一台可放大250倍的简陋显微镜，发现许多肉眼不能发现的“活的小动物”以来，人类对微生物有了初步的认识^[1]，从此显微镜成了微生物检验中最基础的检验设备。

但随着科学技术的不断进步，临床微生物检验也朝着自动化、精准化、智能化的方向发展，特别是近年来分子生物学技术的快速发展和在各级实验室中的普遍开展，微生物鉴定似乎有忽视细菌形态学检查的倾向，过分依赖自动化仪器而轻视手工镜检涂片。

现就痰液标本革兰染色显微镜下发现“鬼影”做一个案例分享。

正在对一天的染色涂片标本进行显微镜检查，突然发现一痰培养标本的革兰染色涂片比较特殊，油镜下见大量白细胞，未见细菌，但仔细观察可见大量未着色的，呈“X”、“Y”、捆状排列的杆状细菌阴影（图1），即“鬼影”（ghost）^[2][3]。

分枝杆菌通常不用革兰染色，然而，重度感染时涂片会显示出串珠样，类似诺卡菌，或可能出现“鬼影”^[4]，为了证实“鬼影”是分枝杆菌造成的，马上对标本进行重新涂片行抗酸染色（冷染），显微镜下可见少量红色的抗酸杆菌，且着色较浅，同时仍然有较多未着色的“鬼影”（图2），为什么会出现这样的现象呢？

我们知道抗酸染色分为冷染和热染，于是又重新对标本涂片进行抗酸染色热染，这时显微镜下可见大量的红色的抗酸杆菌（图3）。

为了更加直观的证实“鬼影”是革兰染色下未着色的分枝杆菌造成的，我们对同一张涂片先进行革兰染色，油镜下观察定位好“鬼影”的位置，接下来用抗酸染液的脱色液对涂片进行脱色后行抗酸染色热染，显微镜下再次找到之前革兰染色定位“鬼影”的位置，可以清晰的看见“鬼影”处有抗酸杆菌的存在（图4）。

图2 抗酸染色冷染x1000

(北京医院陈东科老师提供)

图3 抗酸染色热染x1000

图4

痰培养检出口咽正常菌群生长（两天后）。至此该患者是一个分枝杆菌（结核分枝杆菌？）的感染，于是马上查阅患者的实验室检查结果和病历。

WBC：9.46×10⁹/L，NEU#：7.69×10⁹/L↑，LYM#：0.88×10⁹/L↓，MON#：0.82×10⁹/L↑，NEU%：81.3↑，LYM%：9.3↓，HB：121 g/L↓，HCT：36.5%↓，MCV：74.4fL↓，MCH：24.7 pg↓。CRP：66.36 mg/L↑。余正常。

尿常规检查：正常。

生化检查：Na⁺：133.95 mmol/L↓，Cl^-：97.69  mmol/L↓，β2微球蛋白：3.15 mg/L↑，血淀粉酶（AMY）:56.20 U/L，脂肪酶（Lip）：18.2 U/L。余正常。

现病史：入院前10+小时，无明显诱因出现腹胀、腹痛，以脐周为主，呈持续性钝痛，无刀割样疼痛，无他处放射痛和转移痛，伴肛门停止排气排便；伴恶心、反酸、嗳气，无呕吐。于当地行医院灌肠等治疗后患者病情无明显缓解。

2天前患者受凉后出现咳嗽、咳白色泡沫痰，无胸闷、心悸，无夜间阵发性呼吸困难，无畏寒、发热，无潮热、盗汗。门诊以“腹痛待查：肠梗阻？”收入消化内科治疗。

既往史：既往体质较差。10+年前因胃穿孔行手术治疗（具体不详）；8+年前行阑尾炎切除术；自述8+年前发现肺部良性肿瘤（具体不详）；1+年前应头昏、头痛诊断为“硬膜下血肿”予以手术治疗；2014年12月至今平均每年两次因“肠梗阻”住院保守治疗，期间未行肠镜检查。

有“慢性支气管炎、肺气肿、肺心病”病史，每年患者咳嗽、咯痰时间大于3月。否认“高血压、糖尿病、冠心病”等慢性病史，否认“肝炎、结核、疟疾”等传染病史，否认重大外伤史，否认输血史，否仍食物、药物过敏史。预防接种史不详。

体格检查：T36.6℃，P84次/分，R20次/分，BP113/75 mmHg。发育正常，营养不良，体形消瘦，步入病房，急性痛苦病容，查体合作。腹部平坦，未扪及异常包块，腹软，全腹压痛，右下腹明显，无反跳痛及肌紧张，肝、脾未扪及肿大，Murphy征（-）。双侧胸廓对称呈桶状胸，叩诊呈过清音；无胸膜摩擦感及皮下捻发感；双肺呼吸音减低，左肺可问及散在湿罗音。其余无明显阳性体征。

胸部X线检查提示：慢性支气管炎，双肺炎症，矽肺？肺气肿，右上肺疑有空洞（图5）。腹部X线检查提示：肠梗阻（图6）。

图5 胸部X线检查

图6 腹部X线检查

①急性肠梗阻；②慢性阻塞性肺疾病急性发作期；③慢性肺源性心脏病；④脑动脉供血不足。

从病历和入院诊断可以看出，目前临床未怀疑该患者肺部有分枝杆菌的感染，于是马上和临床主管医生取得了联系，告知微生物实验室经抗酸染色从患者的痰液标本中查见抗酸杆菌（++++），提示患者肺部感染分枝杆菌，疑似肺结核，建议临床做进一步检查。

临床积极采纳了我们的反馈建议，马上对患者行胸部CT，CT提示：慢性支气管炎、肺气肿征；双肺间杂较多小结节状、腺泡结节影，疑似结核肺内播散伴空洞形成（图7）。结合微生物和影像学检查结果，患者高度怀疑肺结核，转上级（传染病）医院进一步治疗。

图7 胸部CT检查 

分枝杆菌（抗酸杆菌）包括结核分枝杆菌（MTB）、非结核分枝杆菌（NTM）和麻风分枝杆菌，其中MTB是引起人类结核病的主要病原菌，可以通过多种途径，如呼吸道、消化道、皮肤黏膜损伤等入侵机体，肺、肠、肾、关节、淋巴系统、神经系统、泌尿系统等全身器官组织皆可感染，临床以肺结核最为常见^[5]。

根据《肺结核诊断标准》（WS 288-2017），1份痰标本涂片抗酸杆菌检查阳性，同时影像学支持肺结核即可确诊，因此本案例患者可确诊为肺结核。

世界卫生组织（WHO）“Global tuberculosis report 2018”报告中显示，2017年我国结核病患者约78万例，但由于肺结核多数起病缓慢，部分患者可无明显症状，仅在胸部影像学检查时发现^[6]，故在没有做胸部影像学检查之前或影像学不典型时极易导致临床漏诊。

那么通过本案例，再次凸显涂片染色显微镜检查的重要性，它可以在给临床快速提供诊断依据的同时，还可以减少临床漏诊，当然前提是我们的微生物检验工作者要具有扎实的检验技能和丰富的临床经验。

值得注意的是，在抗酸杆菌检查的实际工中，我们不能以革兰染色查“鬼影”来取代抗酸染色，因为当标本中抗酸杆菌比较少时，“鬼影”极不容易被发现（图8），而且有的抗酸杆菌在革兰染色中可能不形成“鬼影”。

但我们在平时的工作中，当革兰染色发现“鬼影”时，不要轻易忽视了这样的线索，我们要用抗酸染色加以证实。与此同时，建议临床标本抗酸染色时使用热染的方法，这样可以使抗酸杆菌着色更明显，同时可以提高阳性率。

图8 标本中抗酸杆菌较少时的“鬼影”

本案例中之所以能第一时间查见抗酸杆菌，那是因为我们坚持对临床的每一份合格的标本进行涂片、染色检查。

通过标本直接涂片检查，可以观察到白细胞和鳞状上皮细胞的多少，这是对标本是否合格进行评估的重要依据，特别是在痰液及分泌物标本中，如果白细胞多则提示有感染，相反如果鳞状上皮多则往往提示标本有污染，这样的标本通常不合格；同时直接涂片还可查见病原体，如真菌，寄生虫等。

与之相结合的是染色检查，微生物检验中最常用的是革兰染色，它可以直观的观察到标本中细菌的种类及染色性，同时可以观察到细菌与白细胞的关系，如吞噬、包裹、伴行等；还有一些特殊的染色方法，如墨汁染色查隐球菌，弱抗酸染色查诺卡菌，六胺银染色查肺孢子菌，乳酸酚棉兰染色查丝状真菌（图9）以及各种荧光染色等。

图 9

（注：①图示曲霉菌（痰液，10%KOH×400），②图示蛔虫卵（粪便，直接涂片×400），③图示马尔尼菲篮状菌（痰液，革兰染色×1000），④图示放线菌（脓液，见硫磺样颗粒，革兰染色×1000），⑤图示隐球菌（脑脊液，墨汁染色×400，图片来自中国人民解放军陆军特色医学中心鲁卫平老师）,⑥图示诺卡菌（痰液，弱抗酸染色×1000），⑦图示耶氏肺孢子菌（支气管肺泡灌洗液，六胺银染色×1000，图片摘自《临床微生物实验室真菌检测能力建设基本要求专家共识》），⑧图示曲霉菌（耳分泌物，乳酸酚棉兰染色×400））

我们把涂片染色的结果报告给临床，可为临床诊断和早期的经验性用药提供帮助。同时当染色查见细菌时，可以根据细菌的种类指导我们选择合适的培养基及培养环境；如果培养48小时后没有对应的细菌生长，可提示我们延长培养时间，如果仍没有细菌生长，这是我们要高度警惕厌氧菌的存在。

与此同时，染色下所见细菌的大小、形态、排列方式及染色性都是最终细菌鉴定结果是否准确的重要依据和参考！可见，以涂片染色的显微镜检查，即细菌形态学检查，仍是临床微生物检验中最经典的、传统的和不可缺少的重要手段。

细菌形态学的检查，对鉴定细菌有“导航”的作用，正确的形态学检查结果是准确鉴定细菌的坚实基础^[7]。

微生物实验室应该重视细菌形态学的检查，同时掌握现代先进的检测技术，只有将二者紧密的结合起来，才能为临床病原的发现及微生物鉴定提供新的可能，并为临床提供更多感染信息以提高微生物检验结果的诊断价值和报告质量。