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蛋白质标准化:免疫散射比浊和/或免疫透射比浊检测方法的最佳化 2 ...

归去来兮 2022-12-14 241人围观 技术


蛋白质标准化

-   免疫散射比浊和/或免疫透射比浊检测方法的最佳化   -


冯仁丰

自动化仪器

今天,市场上有多个类型的自动化仪器。一般可分为两个类型:离心分析仪和静态仪器(非离心分析仪)。


b)静态仪器(非-离心分析仪)

这些仪器中比色杯大多安排呈一个圆圈(转子),它缓慢地按照固定时间区间旋转(周转时间)。只能在样品或试剂应用和阅读的区间时,才能进入比色杯。大多情况下使用了机械搅拌设施进行混匀。现代仪器看来越来越多地依据这些原则。


静态分析仪的示例依据透射比浊的包括:Cobas Mira和Mira Plus(ABX Diagnostics,Montpellier,France)、Cobas Integra家属,Hitachi 700-系列和900-系列(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany),Technicon RAXTTM/AXON (Bayer Diagnostics,Munich,Germany),Olympus家属(Olympus Diagnostics GmbH,Hamburg,Germany),Abbott Aeroset(Abbott Laboratories,Chicago,IL,USA),Bayer Advira(Bayer Diagnostics),KoneLab(Thermo Clinical Labsystems,Espoo,Finland),Eppendorf ELAN(Eppendorf, Hamburg, Germany),和Beckman Synchron(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)。


  透射比浊的检测单位是依据正常的分光光度法,使得这些仪器为快速检测和自动的分光光度计。作为一个方式,荧光的一个光学单位,可用于散射比浊检测。只有很少的专业仪器,Dade Behring Nephelometer家属(Dade Behring, Marburg, Germany)和Beckman Coulter ArrayTM(Beckman Coulter)使用了光检测单位,纯粹依据散射比浊仪(或是终点或是动态检测)。


c)软件控制

所有仪器的操作在软件控制下。这个软件的一部分是用户界面,它可以对仪器编程,进行分析和按照某个最佳方式进行计算。分析参数可用为用户控制的在仪器间各异。但是,分析编程(样品体积、预温、加抗体、读数区间、曲线拟合、和计算),为得到最佳和可靠结果是极其重要的。


  有些仪器,但是,为“封闭仪器”,即所有参数设定在仪器上,使用打孔卡或条码识别的试剂/磁带。在这个情况下,用户不可控制检测,但必须完全依赖厂商。

 

基础说明

在透射比浊和散射比浊中各个抗原-抗体反应的特性,必须要研究下列函数,其中信号是光散射或吸光度:


a)信号的形成是时间的函数;

b)反应速率是时间的函数(动态的或速率检测);

c)信号形成是抗原浓度的函数;

- 剂量响应曲线;

- 标准曲线


以下,对这样的检测一般特征进行展现和叙述。


a)作为时间函数的信号的发展

抗原和抗体间反应需要一段时间达到终点。图3展现了信号作为时间的函数的发展。


1、反应的第一步,加入缓冲液到比色杯。由于比色杯里没有发生反应,信号依然恒定。


2、第二步,加入含有抗原的样品。由于含有蛋白质的溶液将引导光的散射和吸收光,造成信号增加。样品信号在较高水平处稳定一个阶段的时间,依赖于蛋白质的浓度,和特别在样品内脂蛋白的水平。这第二步检测被视为“样品预温阶段”或“样品空白步骤”。

图3、信号作为时间的函数的形成。加入缓冲液、抗原(Ag)、和抗体(Ab)到反应比色杯。由箭头说明。


图4、反应速度(速率),为时间的函数。箭头说明加入缓冲液、抗原(Ag)、和抗体(Ab)到反应比色杯内


3、第三步,加入专一的抗体溶液。免疫化学反应即刻开始,在一个阶段时间里发展,通常在4-6分钟后,达到某个终点。但是,一些抗原/抗体系统需要更多的时间使反应完成。


通过从终点信号中减去在添加抗体之前获得的样品信号(样品空白),得到了代表免疫反应的一个信号,可用于计算抗原浓度。随意任选地,可以对抗体溶液本身(试剂空白)的信号进行校正。


b)作为时间函数的反应速度(动态的或速率检测)

免疫化学反应的速度(形成不溶性免疫复合物)随着反应的进行变化很大。这个反应速度、或是速率,可以概述为每单位时间的变化(图4)。数学上,这个曲线代表了图3的微分形式,各个步骤实际上是相同的。

加入样品后,反应速度从最大后它稳定趋向零。在加入抗体并与抗原混合,观察到的是相同的。在开始处,反应速度快速增加,然后它达到最大,最后缓慢地下降趋向零(终点)。最大反应速度,速率(max),是 — 处于恒定的抗体浓度— 是加入抗原量的函数。为准确地计算这个速率(max),必须频繁阅读结果,每0.1到0.2 秒阅读一次;在整个检测时间里,样品必须恒定地置于光路下。


c)作为抗原浓度函数形成的信号

剂量-响应曲线

通过绘制在恒定抗体浓度下,随抗原浓度增加得到的信号关系,得到剂量-响应曲线。为了得到完整的剂量-响应曲线,必须使曲线达到最大,并开始减少直至趋向于零。这与Heidelberger和Kendall曲线在图1中叙述的是类似的;尽管剂量-响应曲线是在透射比浊下得到的,需要有多得多的稀释系统。剂量-响应曲线合适部分在平衡区的左侧 — 即在抗体过剩区 — 被选择和用作标准曲线。


标准曲线

标准曲线是剂量-响应曲线的一部分,被选定覆盖了各个蛋白质关联的检测范围。标准曲线可从校准检测批获取,记录来自校准品不同稀释液得到的信号,与已知检测蛋白质的浓度。


图5显示了用于免疫透射比浊的最适标准曲线。

图5、最适的标准曲线(免疫透射比浊)。Ag:抗原、mAbs:百万分之一的吸光度、Std:标准。

TO BE CONTINUED

来自: 冯仁丰
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