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小曲线大学问-新冠核酸异常扩增曲线知多少?

归去来兮 2022-3-14 1177人围观 技术

实时荧光 PCR 技术是新冠病毒核酸检测的主要方法。每一个标本的检测结果都会以一张扩增曲线图呈现,需要我们的「专业慧眼」去辨析,判断出「阴性」还是「阳性」。在实际工作中,核酸扩增曲线并非次次「完美」,易受到多种因素影响。因此如何判读扩增曲线,对准确报告新冠核酸检测结果至关重要。



01 正常扩增曲线长啥样?

正常扩增曲线呈 S 型,分为基线期、指数起始期、指数扩增期和平台期,且要求拐点清楚,整体平行性好,基线平而无上扬现象。



02  异常扩增曲线解析

异常扩增曲线是核酸检测人员最为头疼的问题。辨别扩增曲线形态、分析产生异常扩增曲线的原因是检测人员的必备技能。每一条扩增曲线的判读需要慧眼识别和经验处理。我们总结了检测过程中遇到过的异常扩增曲线,与大家进行分享。

① 内标扩增曲线异常

正常的内标扩增曲线是实验有效性的基础,可反映样本质量、抽提和扩增效率。

曲线特点

【类型一】某标本内标无 S 型扩增曲线。

【类型二】外源性内标呈离散型曲线。


原因分析

a) 标本采样欠佳,没有刮取到足够的鼻咽部细胞。

b) 标本保存不当,核酸降解。

c) 标本加错位置或漏加。

d) 提取失败:裂解液未混匀(外源性内标)、提取仪故障等。

e) 扩增失败:漏加反应液、模板加错孔位、混入抑制扩增反应的干扰物等。


解决方案

a) 重新采集样本。

b) 送检标本及时检测,室温放置不超过 4 h。

c) 按照规范化流程进行相关操作。

d) 定期对在岗人员进行操作考核。


【注】内标扩增曲线异常,则该批或相应标本结果无效,需重新采样或重新检测。



② 基线设定不当的异常扩增曲线


曲线特点:软件默认基线设定的扩增曲线呈波浪型,导致 Ct 值偏大,可能会被误判为阴性。


原因分析:软件默认基线设定不准确造成扩增曲线异常。


解决方案:根据检测试剂的要求设定适宜的基线。


③ 软件优化造成的异常扩增曲线

曲线特点:软件优化后扩增曲线向斜上方抬起,导致 Ct 减小,根据优化后扩增曲线会误判为阳性,但原始信号未有明显扩增。


原因分析:根据设定基线,软件在自动优化扩增曲线时会放大微小异常信号。


解决方案:查看原始曲线,对基线稍作调整。


【注】自动优化软件会放大微小的异常信号,可根据原始曲线判断信号真假。

④ 多个标本单靶标通道翘尾

曲线特点:多个标本出现单靶标通道的扩增曲线翘尾。


原因分析

a) 反应液配制后保存不当,如荧光探针断裂。

b) 存在阳性质控污染或者其他荧光物质污染。

c) 扩增试剂 / 耗材的批间差异导致非特异性扩增增加(如试剂更新后 Mg2 + 浓度过高)。


解决方案

a) 按照说明书要求保存配制的扩增反应液。

b) 提取得到的核酸应及时进行后续处理,否则及时封盖,避免混入阳性质控或其他干扰物;实验室每天按时清洁消毒以消除潜在的干扰因素。

c) 试剂 / 耗材批号更换前应进行比对实验验证。


⑤ 靶标通道呈低平 S 型曲线

曲线特点:标本靶标通道呈低平且非典型 S 型扩增曲线,标本与弱阳性质控的荧光强度存在显著差异。


原因分析

a) 标本存在干扰物质。

b) 提取纯化不完全。


解决方案:标本重新检测,必要时可使用不同的检测试剂进行确认。


【注】对疑似标本建议使用不同的检测试剂进行确认。在异常扩增曲线判断时,应根据整批标本的扩增情况(弱阳性质控扩增曲线)综合判断。


⑥ 蒸发引起的异常扩增曲线

曲线特点:反应体系蒸发,终体积减少,荧光强度产生变化导致阴性扩增曲线整体呈斜向上或山域型。


原因分析

a) 在扩增过程中因热盖导致管盖爆裂 / 光学膜破裂。

b) 未盖紧管盖 / 刮紧光学膜。

c) 未使用配套 / 质量合格的耗材。


解决方案

a) 定期检查扩增仪状态,确保热盖温度正常。

b) 上机前盖紧管盖 / 刮紧光学膜。

c) 使用厂商推荐的合格扩增耗材。

d) 调整基线可适当纠正蒸发引起的异常信号,有助于后续的扩增曲线判读。


⑦ 气泡引起的异常扩增曲线

曲线特点:扩增曲线出现剧烈或明显曲折。


原因分析:反应体系内有大气泡形成折射,干扰荧光的采集。


解决方案

a) 加样时减少气泡的产生,同时上机前可通过离心减少气泡。

b) 调整基线可适当纠正气泡引起的异常信号,有助于后续的扩增曲线判读。


⑧ 锯齿型异常扩增曲线

曲线特点:所有通道的扩增曲线出现锯齿状。


原因分析:扩增仪电压不稳、采光或者滤光片故障。


解决方案:检查扩增仪电压和光路系统,及时排除硬件故障,防止后续检测的异常结果。若扩增仪故障严重影响扩增曲线判读时应重新检测。

总结

新冠核酸检测过程中每一个环节的操作都有可能产生异常扩增曲线,干扰结果判读。检测人员在上岗前需完成操作培训和考核,在实际工作中严格遵循规范化流程,掌握专业知识,积累实践经验,才能保证新冠核酸的检测质量。



作者:黄斐

审核:郭玮

单位:复旦大学附属中山医院检验科


来自: 检验医学网 | 作者:黄斐
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