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mNGS临床应用进展

归去来兮 2022-1-10 50人围观 医学

推荐理由

感染性疾病的病原体种类多样,除常见的病原体外,罕见细菌、病毒、真菌及寄生虫等病原体不易被传统的方法检测,给临床诊断带来困难,导致漏诊和延误,或造成抗生素药物的滥用。近年来,随着测序技术的飞速发展,二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术已逐步应用于感染性疾病的诊断、治疗和监测。宏基因组测序(metagenomics next generation sequencing,mNGS)技术是对样本中所有核酸进行无偏倚测序,结合病原微生物数据库及特定算法,检测样本中含有的病原微生物序列,在病原微生物的鉴定、分型、耐药突变检测及新型病原体鉴定等方面具有独特的优势和吸引力。

早在2014年,美国Charles Chiu教授首次应用mNGS技术诊断了一例神经系统钩端螺旋体病例[1],而这类疾病依靠常规检测方法是难以检出的,此次应用证实了mNGS技术在病原微生物鉴定领域,尤其是疑难微生物鉴定方面的应用潜能。随着该技术的社会经济成本不断降低和技术的不断完善,mNGS已逐渐从科研走向临床应用,成为临床疑难和未知病原微生物检验的重要手段。2020年12月13日,复旦大学附属中山医院感染病科的胡必杰教授团队在Small Methods上(IF=12.13)发表了一篇题为“High-Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings”的综述,对高通量测序技术在感染病原检测方面的应用进行了详细地阐述,特摘综述的部分节选,以飨读者。

高通量测序技术在临床诊断的应用

High-Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings


高通量测序技术发展历程[2]

测序技术面世至今,测序技术和测序平台不断更迭,而且测序读长不断加长、通量不断提升、时间不断缩短。1977年出现了以Sanger测序技术[3]为代表的一代测序,其主要特点是测序读长长(可达1000bp),准确性高。然而,一代测序由于测序成本高,通量低等方面的缺点,严重影响了其真正大规模的应用。

现阶段,二代测序(NGS)技术大大降低了测序成本,大幅提高了测序速度,并且保持了高准确性。但是,NGS存在序列读长短、后续的分析依赖于片段拼接可能影响准确度以及测序运行时间较长的问题。因此,二代测序仍有改进的空间。

三代测序技术又称单分子测序技术,与NGS相比,三代测序技术每秒可检测10个核苷酸,大大缩短了测序时间。此外,三代测序可实现DNA/RNA直接测序、无需PCR扩增以及无GC偏好性的优点。尽管第三代测序具有诸多优势,但由于其错误率高、成本高,目前仍未在临床应用中得到广泛应用。

表1. 病原微生物高通量测序平台参数汇总[2]


高通量测序检测流程

mNGS分为两个技术环节,即实验操作环节(也称“湿实验”),和之后的生物信息学分析环节(也称“干实验”)。湿实验包括临床样品处理、文库制备和测序步骤;而之后的生物信息学分析是mNGS中的重要部分,是对测序产生的原始数据进行处理和分析,包括但不限于数据质控、人源序列比对过滤、微生物物种鉴定等过程[2]。所以就具体操作流程而言,mNGS主要包括对待测样本进行核酸提取(DNA提取和RNA反转录)、文库构建、上机测序、数据处理和结果解释等步骤[4]

图1. mNGS在临床应用中的测序流程[2]


mNGS在不同系统感染中的应用

血液系统感染

近十年间,对引发脓毒症的感染病原体研究发现,各种感染性病原体在脓毒症中所占的比例不同,尽管由革兰氏阴性菌、厌氧菌和真菌感染导致脓毒症的报道屡见不鲜,但是革兰氏阳性菌仍然是最常见病原菌。然而,目前仍有约50%的脓毒症患者其致病菌不明确,即培养阴性脓毒症。尤其是急性感染和重症脓毒症患者如未能及时进行有效的抗生素治疗,则病死率高,此类患者急需在短时间内明确致病病原菌。因此,临床迫切需要快速和灵敏的病原微生物诊断技术。

多个病例报告和研究表明,血浆中循环或非循环病原体的无细胞病原体DNA或RNA可能与感染有关,mNGS技术通过对血液样本中的游离DNA(cfDNA)或游离RNA(cfRNA)进行测序,可鉴定病原体。多项研究报道提示,mNGS与血培养结果的一致性达93.7%,在鉴定脓毒症致病菌方面比其他检测方法更有效。而且,mNGS测序总体检测阳性率高于培养,可以识别出传统培养方法遗漏的潜在细菌病原体。

值得注意的是,虽然健康人血液通常被认为是无菌环境,但偶尔也能检测到细菌DNA,尽管如此,健康人与脓毒症患者血液病原菌的组成还是存在显著差异。研究表明,在健康人血液中检测到厌氧菌居多,其中大多数是双歧杆菌类细菌,而脓毒症患者血液中,大部分为需氧或微需氧微生物。因此,虽然在健康人血液中检测到细菌DNA,提示细菌进入血液系统中,但其并不总是导致败血症。上述研究结果有助于对疑似脓毒症患者mNGS检测结果的解读。

综上所述,mNGS对病毒、结核、厌氧菌、真菌和寄生虫,以及混合感染诊断方面优势明显,对抗菌药物的治疗方案具有指导意义,可以有效避免血流感染患者的抗生素滥用,与此同时,mNGS检测时间可缩短至24小时,大大提高患者生存率。

中枢神经系统感染[2]

感染中枢神经系统的病原体种类多样,其症状包括脑膜炎、脑炎和脓肿,往往威胁患者生命。然而,传统病原体检测方法尚不能有效涵盖临床感染性疾病的病原谱,尤其是罕见病原体。此外,CNS感染性疾病确诊的依据在于从脑实质或脑脊液(CSF)内检测到病原微生物,但是由于脑脊液和脑组织样本取材相对困难,且标本量小,限制了CNS感染性疾病病原体的检出。因此,CNS感染患者往往未能查出病因,尤其在急性脑膜脑炎患者中高达50%,临床迫切需要快速、准确的诊断技术。

近十年来,mNGS在临床感染性疾病的诊断中显示出了极大的潜在价值。目前已有多个病例报道应用mNGS技术从脑脊液和脑组织中鉴定出病毒、细菌、真菌、寄生虫等,并表明mNGS在诊断难度较大的亚急性或慢性脑膜炎病例中具有突出价值。研究表明,在CNS细菌性感染中,mNGS比传统检测方法的总体检出率更高,但仍不能取代细菌培养等传统检测方法,建议将mNGS与常规微生物学检测结合使用,从而提高致病菌的检出率。mNGS在结核性脑膜炎(TBM)患者CSF的检测中具有较高的灵敏度、特异性和阳性预测值(PPV)。mNGS的敏感性显著高于传统培养法,并且mNGS与常规方法相结合可以最大限度地提高TBM的检出率。上述结果表明,mNGS可作为TBM诊断的前沿诊断工具。在真菌检测方面,mNGS在诊断隐球菌性脑膜炎和脑曲霉病中的敏感性分别为76.92%和80%,与传统检测方法结合也可显著提高检出率。在CNS病毒感染中,同时进行DNA和RNA测序可以提高CSF品中病毒的检出率。除此之外,mNGS技术在检测诊断困难和少见的病原体上也呈现了巨大的优势,如单核细胞增多性李斯特菌、布鲁氏菌、福氏耐格里阿米巴、脑囊虫以及创伤弧菌。

mNGS另一个应用前景是鉴别传染性和非传染性病因,并且帮助临床指导用药。脑脊液mNGS可看做在自身免疫性疾病确诊之前,排除广谱潜在CNS传染病的适当工具。与培养法相比mNGS受抗生素药物影响更小,但如果患者在脑脊液采样之前接受抗菌治疗时间延长,那么mNGS的检出率将显著下降。此外,mNGS半定量可协助临床监测疾病进展和治疗效果,但由于mNGS存在假阴性的可能,对于mNGS检测结果阴性的情况,仍需谨慎对待。

综上所述,mNGS在结核、真菌以及罕见病原体方面具有突出优势、受抗生素影响小、可进行传染性和非传染性病因的鉴别。因此,推荐mNGS可作为慢性和复发性中枢神经系统感染的一线诊断方法,急性脑炎病例的二线诊断方法。

呼吸系统感染[2]

上呼吸道感染和下呼吸道感染是临床常见病,也是造成免疫抑制人群死亡的重要因素。呼吸道感染是由病毒、细菌、真菌和寄生虫等多种病原体感染所致,感染的病情轻重不一,严重者亦可导致肺炎。毫无疑问,病原检测和鉴定对于精确治疗和改善患者预后至关重要,但是呼吸道感染患者常接受经验性广谱性抗生素治疗,如频繁和不适当地使用抗生素会限制培养法检测的敏感性和准确性。

宏基因组测序技术无需预先假设,可一次性检测多种病原体,并且多项临床研究已经证明了其可以快速、准确的协助诊断肺部复杂感染和重症感染。众所周知,细菌是下呼吸道感染最常见的致病菌,例如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌,除上述细菌以外,mNGS与传统的培养方法相比可以鉴定出更多的细菌,包括结核分枝杆菌复合群(MTB)、非结核分枝杆菌(NTM)、诺卡氏菌和各种放线菌。此外,mNGS在辅助肺部侵袭性真菌感染、肺部混合性感染和重症无反应性肺炎诊断方面也具有一定的价值,尤其在免疫功能低下患者的研究中,mNGS的检测准确率甚至可以达到100%。

mNGS在新发病原体检测方面的优势及应用价值毋庸置疑,尤其对呼吸道病毒(例如SARS-CoV,MERS-CoV和H7N9)的检测,mNGS可作为助力疫情跟踪和监控的有效方法。

此外,mNGS对不同呼吸道标本类型的检测灵敏度也存在差异。mNGS在外周肺感染性病变的诊断中,经支气管镜肺活检(TBLB)组织样本的特异性要高于肺泡灌洗液(BALF)样本,但是BALF样本的敏感性更高;在痰液和组织样本类型中,mNGS检测与培养法相比具有更高的灵敏度。就目前的报道来看,mNGS检测的总体灵敏度在不同的呼吸道样本中差异不显著。虽然在常见细菌检测方面mNGS的灵敏度并不优于培养法,但是,mNGS在结核,真菌,病毒和厌氧菌诊断方面优势更明显。

骨和关节感染[2]

在人工关节置换术和人工关节翻修手术后可能引发骨和关节感染(bone and joint infection,BJI),BJI有较高的致病率,特别假体关节周围感染(periprosthetic joint infection,PJI)可引发严重的并发症。然而,关节感染患者往往临床细菌培养结果为阴性,阴性结果不仅影响临床抗生素的使用,而且无法明确病因,对患者和医生造成困扰。

mNGS是提高BJI诊断效率的有效补充方法,检测样本类型包括滑膜液、植入物的超声清洗液以及假体周围的组织。值得注意的是,检测超声清洗液可能比滑膜液更有利于区分主要致病菌和污染菌。因为致病菌通常存在于假体表面的生物膜中,超声处理可以裂解植入物表面的生物膜,从而提高样本中致病菌丰度。综上所述,推荐微生物培养结果为阴性、经验性抗菌药物治疗效果不佳以及清创效果差的患者使用mNGS进行病原检测。

尿路感染[2]

尿路感染(urinary tract infections,UTI)是常见的社区获得性感染,可致尿路感染的病原体有细菌、真菌及病毒(即多瘤病毒和人疱疹病毒)。其中大肠埃希菌是最常见致病菌(约占75%),常见于复杂性尿路感染和非复杂性尿路感染,而复杂性尿路感染可由多种细菌感染所致,大大增加了病原体检测的难度。mNGS不依赖培养技术,以其检测速度快、灵敏度高等明显优势,为临床医生提供精准诊疗的依据。

此外,尿液检测中的限制点在于报告解读难度大,原因包括:①尿液样本采集前和采集后不正确的取样方式,均容易污染样本。②远端尿道、尿道周围皮肤以及阴道定植菌会干扰报告判读,因为对免疫功能低下的患者,某些条件致病菌也可能会引起疾病。③患者可能经常出现无症状持久性或潜伏性的感染。因此,明确尿路感染的病因,需要有经验的临床医生参与解读。

消化系统感染[2]

消化系统感染主要为胃肠道感染,主要致病细菌包括源自外部环境的侵入性肠致病菌和正常肠道共生菌。人体消化道内有很多共生定植细菌,近年来,肠道微生物菌群已成为研究的热点。然而mNGS在肠道致病菌检测中的应用较少,主要应用于粪便样品中非细菌(例如轮状病毒A,隐孢子虫和人副肠弧病毒)、急性胆囊炎患者致病菌、罕见病毒以及急性肝衰竭患者的合并感染的检测。此外,mNGS在肠道病原菌耐药基因检测方面也具有重要的价值。

复杂和非典型的病原体感染[2]

许多病例研究已经证明了mNGS在多方面的优越性,包括:①鉴定复杂和非典型病原体感染方面,如鹦鹉热衣原体、军团菌属以及难培养的厌氧菌和分枝杆菌;②人畜共患病原体,如猪链球菌、恙虫病东方体、钩端螺旋体和弓形虫;③新发RNA和DNA病毒,如博卡病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒和新型冠状病毒等。


总结

多个文献报道已证明,mNGS应用于临床诊断方面具有明显优势。在众多的分子检测手段中,mNGS作为一种全面直接的检测方法,虽然存在经济成本等问题,使mNGS很难在短期内成为临床一线检测手段,但在传统微生物检验阴性、经验治疗失败、疑难杂症、不明原因的危重症、免疫缺陷等特殊患者人群以及新发突发传染病的诊断中仍是一种非常高效的病原体筛查方法[5]。尽管如此,各种检测策略各有所长,mNGS不太可能在短期内取代传统的诊断方法,在某些临床情况下,它可能是一种补充性的,以及有必要的检测手段[6]。值得注意的是,如果将mNGS与传统培养、其他分子生物学以及血清学检测等方法联合使用,将会使更多医生和患者受益,从而真正地实现感染性疾病的精确诊断。

mNGS临床应用检测策略推荐[7-11]

参考文献

  1. Wilson M, Naccache S, Samayoa E, et al. Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing[J]. N. Engl. J. Med., 2014, 370(25): 2408-2417.

  2. Li N, Cai Q, Miao Q, et al. High-Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings[J]. 2021;5(1):2000792.

  3. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chainterminating inhibitors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1977, 74(12): 5463-5467.

  4. Kwong JC, McCallum N, Sintchenko V, et al. Whole genome sequencing in clinical and public health microbiology[J]. Pathology, 2015, 47(3): 199-210.

  5. Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics[J]. Nature Reviews Genetics, 2019, 20(6): 341-355.

  6. Hogan C, Yang S, Garner O, et al. Clinical Impact of Metagenomic Next-Generation Sequencing of Plasma Cell-Free DNA for the Diagnosis of Infectious Diseases: A Multicenter Retrospective Cohort Study[J].Clin Infect Dis. 2021;72(2):239-245..

  7. 张文宏. 中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识[J]. 中华传染病杂志, 2020, 38(11):681-689.

  8. 童朝阳. 宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识[J]. 中华急诊医学杂志, 2019, 28(2):151-155.

  9. 鲁辛辛. 高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识[J]. 中国检验医学杂志, 2020, 43(12):1181-1195.

  10. 李颖, 麻锦敏. 宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)[J]. 中华危重病急救医学, 2020, 32(5): 531-536.

  11. 王辉. 宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2021, 44(02): 107-120.


 

本文编辑:乐乐高

来自: 欧蒙医学诊断
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