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原博士谈非洲猪瘟病毒抗体检测(采访汇编)

归去来兮 2021-9-13 86人围观 技术


小科

非洲猪瘟抗体ELISA检测对实验室有什么要求?

原博士


ELISA检测实验室的要求相对核酸检测来说是比较简单的,不需要分区,但是还是要满足一些基本的要求。首先最关键的是对环境温度的控制,通常情况下要求整个的温度大概在25℃—30℃的范围内;其次要配备一些基本设备,最主要的是培养箱和酶标仪。再者对于我们常规实验室的话,还要有纯水的制备系统,保证实验用水质量合格,这样的话就能保证实验室可以顺利进行ELISA实验的开展。



小科

影响检测结果的因素有很多,为了确保检测结果更加准确,实验室使用非洲猪瘟抗体ELISA试剂盒做检测的时候有哪些注意事项?

原博士


实验室在做试验的时候,都需要在人、机、料、法、环的每个环节进行控制。首先操作人员要熟悉试剂盒的操作,其次是仪器设备要保证整个ELISA试验的顺利进行,核心的是温箱,需要将温度控制在37℃,或者有一些试剂盒要求是25℃。当然,我们最核心的做ELISA试剂盒的检测仪器是酶标仪。酶标仪每年需要进行校准,目前不同的试剂盒对波长的要求不一样,最起码需要做到满足450 nm492 nm650 nm个波长的酶标仪。除了整个的试验环境需要满足要求外,使用的试剂也应该从农业农村部发布的33个试剂盒里面去选择。



小科

目前大家对于检测结果假阴性和假阳性的问题都比较关注,如何确定临床检测的假阳性和假阴性的结果?

原博士


检测结果的假阳性和假阴性确实是ELISA检测中最大的一个问题。因为目前所有的ELISA试剂盒都无法避免假阳性和假阴性的问题,所以用户在使用ELISA抗体检测的时候,对于单个样品的检测其实都存在一定的比例,都会出现一些假阳性和假阴性的情况。

如何去识别这些假阳性假阴性呢?首先大家要知道,做ELISA抗体检测的时候产生假阳性结果的原因有以下几个方面:第一,如果使用溶血的血清,溶血的血红蛋白的成分可能会导致假阳性的结果。第二,根据国家标准,要求使用血清样本来进行抗体的检测。但是如果使用血浆样本,由于血浆里面存在着纤维蛋白,那纤维蛋白的存在也可能会导致假阳性的结果。第三,如果血清被细菌污染了,细菌中的一些成分也可能会导致假阳性的结果。第四,是动物自身存在的状况。如果动物的血清里面存在着一些补体和类风湿因子,也可能会导致假阳性的结果。第五,所有的ELISA抗体试剂盒的蛋白都达不到100%纯度,所以一定含有杂质,这些杂质也会产生一些非特异的结合而导致假阳性。但是这种假阳性的出现会有随机性,很难去判断。所以我们在临床使用ELISA抗体检测试剂的时候,一定要知道存在假阳性的比例。

导致假阴性的结果有以下几个原因:第一,可能是血清样品保存不当,导致了血清腐败。第二,可能是动物处在感染的早期,抗体还没有达到ELISA试剂盒的检测限,所以没能检测到。第三,可能是使用的试剂盒的敏感性不够,所以没有能检测到抗体。第四,也有可能是操作人员操作不当导致的假阴性结果。

以上是目前我们在临床使用过程中,产生假阳性和假阴性结果可能的影响因素。



小科

如果使用两个非洲猪瘟抗体ELISA检测试剂盒来检测,检测结果不一致,这种情况下我们该如何处理?

原博士


使用ELISA的试剂盒对非洲猪瘟抗体检测确实存在着很多的难点。第一个难点就是每一种试剂盒都有一定的假阳性和假阴性结果比例,因为目前每一个试剂盒都不是完美的,我们无法靠单一的试剂盒去做确定性的结论。所以在这种情况下,可能需要我们每一个实验室根据自己的目的和具体的情况,制定多个试剂盒联用的策略。

第一种策略叫平行实验,就是使用两种试剂盒检测同一份血清,只要有一个试剂盒检测是阳性,那就把这个血清定为阳性样品。这种方法可以增加试剂盒整体的敏感性,但也会导致一些假阳性的产生。

第二种策略叫序列实验,就是说使用第一个试剂盒检测出阳性之后,再用第二个试剂盒进行检测,两个试剂盒检测结果都呈阳性之后才判这个试剂盒为阳性。这种方法牺牲了敏感性,提高了特异性。但是ELISA试剂盒之间的比较其实是没有确定性的结论的,所以我们也需要引入“金标准”的方法。根据世界动物卫生组织《陆生动物手册》关于非洲猪瘟这一章内容里面,抗体检测的金标准有三种:间接免疫荧光、间接免疫酶和免疫印迹。在我们国家颁布的《非洲猪瘟诊断技术》的国家标准里面,也将间接免疫荧光列入了抗体检测的方法。所以我们可以通过金标准的方法对这些抗体进行最终的复核。

中科基因作为行业的第三方检测实验室,很快在北京实验室和洛阳实验室也会推出非洲猪瘟抗体的间接免疫荧光的检测服务,希望感兴趣的朋友可以和我们联系。



小科

非洲猪瘟病毒核酸和抗体的检测如果结果不一致的话,应该如何处理?

原博士


核酸和抗体检测结果有几种不同的情况。其一,如果是非洲猪瘟的核酸检测呈阳性,抗体检测也呈阳性,说明这个时候非洲猪瘟处于感染的活跃期。第二,非洲猪瘟的核酸检测结果是阳性,但是抗体检测结果是阴性,这种情况有可能发生在非洲猪瘟感染的早期,病毒刚刚进行感染,抗体浓度还未有明显增长。第三,核酸检测结果是阴性,抗体检测结果为阳性,这种情况有可能是非洲猪瘟感染的后期。第四,非洲猪瘟的核酸和抗体检测结果都是阴性,一种情况是有可能没有感染,也有可能是在感染的潜伏期。

所以,我们目前对于非洲猪瘟的检测需要核酸和抗体同时进行,尤其是在猪群的调运过程中,我们必须要核酸、抗体双阴性才可以进行种猪的调运。不管是核酸还是抗体检测,只要有一个结果呈阳性,就应该被视为是感染的阳性猪,需要被淘汰。一旦核酸呈阳性,猪只可能会终身带毒。所以建议广大的养殖者,在非洲猪瘟不管是抗体检测阳性,还是核酸检测阳性,只要有一个阳性结果,就要对猪只进行淘汰和处理。



小科

实验室进行非洲猪瘟抗体检测时如果样品的数量很大,能否对样品进行混样检测?

原博士


这个问题特别好。因为3月份,国家非洲猪瘟参考实验室发布了《养猪场非洲猪瘟变异株监测技术指南》。在这个“指南”里面提到:“病原学检测如果进行混样,建议混样的数量不应该超过5个,抗体检测不得混样。”所以对于非洲猪瘟实验室进行非洲猪瘟抗体检测时,是不建议混样检测的。



小科

如果实验室在检测的时候进行混样会有什么影响?

原博士


对于病原检测,在样品量很大的时候可以进行混样检测。因为常规的检测方法是荧光定量PCR,这种方法的灵敏度其实是很高的,有很多试剂的最低检测限可以检测到1 Copy/μL这样低的一个样品浓度。样品中病毒含量相对比较高的时候,即使混样检测我们仍然可以检测到病毒的存在。

但是,如果进行抗体检测,其灵敏度要比抗原检测要低很多个数量级。所以在抗体的检测中,混样可能会导致阳性样品的漏检和假阴性的出现。


小科

非洲猪瘟抗体检测除了使用血清样本,是否还可以选择使用其他样本?比如说唾液、奶水、腹腔液等。

原博士


根据《非洲猪瘟诊断技术》的国标里面的要求,抗体检测是推荐使用血清进行检测的。那对于刚才您提到的这个唾液或者是腹水,或者是其他的这种体液,目前来看,在没有详细数据支持的情况下我们还是不建议使用。未来可能随着技术的发展,或者是随着更多的试验数据的出台,如果是能对唾液进行检测,对于采样来说是更加方便的,但是目前来看还是缺少相关的试验数据。



小科

如果说使用这些样本检测,与血清样本之间的吻合度有多高?

原博士


目前因为很多的试剂盒厂家都没有提供相关的数据,所以不方便去评论这个相关的吻合度问题。还是需要等各家试剂盒的详细的试验数据出台之后,我们才有可能去进行评估。



小科

在使用非洲猪瘟抗体ELISA试剂盒检测时,会不会有因抗体水平低而检测不出的情况?一般在感染后多少天能够检测到抗体?

原博士


应该是会有的。因为根据非洲猪瘟抗体的一些文献报道,非洲猪瘟感染之后IgM抗体产生时间大概是5—7天,而IgG的产生时间大概是7—14天。所以在感染的初期有可能是检测不到抗体的。中国动物疫病预防控制中心审批的33个试剂盒中,有4个试剂盒是抗原夹心的ELISA。抗原夹心的ELISA理论上是可以检测总抗体的,可以对IgM抗体、IgG抗体进行检测,理论的检测时间最早可以到5—7天。但是对于常规的间接ELISA和阻断ELISA,通常情况下都是用来检测IgG抗体。这类试剂盒可能最早的检测时间大概是7—14天,所以大家在使用的过程中要根据试剂盒的原理来进行判断。



小科

猪场在日常筛查和猪群调运以及“拔牙”时,对于不同的检测目的,该如何选择试剂盒?

原博士


在我们日常的工作中该如何选择ELISA试剂盒是一个难题。对于不同的ELISA试剂盒,每一个厂家根据其使用目的会对试剂盒进行调试。这样的话,有一些试剂盒可能是敏感性会调试的比较好,另一些试剂盒可能更注重特异性。但是由于ELISA试剂盒的敏感性和特异性是一个跷跷板,不可能有哪个试剂盒可以做到敏感性和特异性都是100%。所以,不同的试剂盒有一些是敏感性会更高,有一些是特异性会更高。

针对不同的使用场景该如何去选择呢?通常情况下,如果作为一个日常“拔牙”的猪场,可能最优先的会选择能检测感染早期的试剂盒,选择夹心ELISA可能比常规的检测IgG抗体的试剂盒要早3—5天,这对于整个场里面的剔除就很有必要。对于一些发病场,我们可能会选择敏感性更高一点的试剂盒,即使有一定的假阳性比例,但可以尽量把发病的猪一网打尽。

如果要对养殖场进行净化,也是要使用敏感性更高的试剂盒,也可以使用联用的方法。先使用敏感性高的试剂盒对整个的猪群进行初筛,然后再用特异性好的试剂盒进行复核。对于没有非洲猪瘟的感染的一个无疫状态,可能会选择特异性更高的试剂盒。

所以在试剂盒的使用的时候,也是要根据不同的场景,然后根据不同试剂盒的特征进行挑选。



小科

除了可以利用ELISA试剂盒检测非洲猪瘟病毒外,还有哪些方法可以用于检测非洲猪瘟病毒抗体?

原博士


虽然这次中国动物疫病预防控制中心公布了33个ELISA抗体的检测试剂盒,但实际上对于抗体检测还有很多其他的策略。目前最主流的当然是ELISA抗体检测,也是目前应用最广泛,普通实验室都可以进行使用的检测方法。它的操作也比较简单,需要的仪器也是相对简单,可以适应高通量的检测。

其次就是胶体金,还有一些其他的检测方法,包括镧系金属元素标记,或者是一些发光元素标记这样的技术。这些技术的优点就是不需要仪器设备,可以做现场检测。缺点是可能会产生一定的非特异性结合,会更容易受到血清的杂质干扰,敏感性可能不如ELISA高。

还有一种是目前在医学上使用最广泛的化学发光法,利用抗原抗体和磁珠进行结合,可以实现完全的自动化。它拥有更高的敏感性和特异性,但是需要专门的仪器。所以像胶体金、化学发光,虽然目前没有在兽医主管部门批准使用于非洲猪瘟的抗体检测,但是还是有很广阔的应用前景和在特定的使用场景下的优势的。


来自: 原博士带你做检测 | 作者:中科基因资讯
我有话说......