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科普 | 新冠病毒核酸检测(荧光PCR法)原理

2021-8-13| 发布者: 归去来兮| 查看: 797| 评论: 0|来自: 诊断科学 | 作者:赛先生

摘要: 截至2020年3月27日,国家药监局已经应急批准23个新型冠状病毒检测产品。其中新冠病毒核酸检测试剂15个,抗体检测试剂8个。病毒核酸检测,其实就是对病毒的遗传物质RNA进行检测。目前主流方法为实时荧光 RT-PCR 法, ...


截至2020年3月27日,国家药监局已经应急批准23个新型冠状病毒检测产品。其中新冠病毒核酸检测试剂15个,抗体检测试剂8个。

病毒核酸检测,其实就是对病毒的遗传物质RNA进行检测。目前主流方法为实时荧光 RT-PCR 法,全称 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,逆转录-聚合酶链式反应。其具体步骤分为采集样本、提取 RN A、逆转录成cDNA、PCR扩增、结果分析。


01

采集样本

由于新冠病毒是通过呼吸道感染人体,所以样本要从呼吸道采集。


目前常规的样本类型大致有两类,一类是用咽拭子、鼻拭子,在人的上呼吸道(咽部或鼻腔)擦拭采集;另一类是收集下呼吸道痰液、支气管灌血液、肺泡灌洗液等。

通常肺部灌洗液和痰液中的病毒核算量高于鼻咽等呼吸道拭子。而呼吸道拭子中的病毒核算量会远远高于血液。采集到的样本将被低温封存,并送到专门的检测机构进行检测。


02 

提取 RNA

提取 RNA主要方法有 Trizol法、离心柱法、磁珠法。


Trizol法


Trizol法基本步骤为 Trizol裂解、氯仿抽提、异丙醇沉淀、乙醇洗涤,晾干、DEPC水溶解。


01

Trizol裂解

往样本中加入Trizol试剂,Trizol的主要成分是苯酚,能裂解病毒的蛋白质成分,使RNA从病毒中游离出来。


02

氯仿抽提

添加氯仿会使蛋白质变性沉淀,同时氯仿是有机溶剂,苯酚易溶于氯仿中,而RNA易溶于水,却不溶于有机溶剂。

经离心后有机溶剂存在于试管底层,RNA存在于上层水相中。吸取上层水相于新的EP离心管中。


03

异丙醇沉淀

加入等体积的异丙醇,再放入离心机中。异丙醇能夺取RNA周围的水分,使RNA聚集而发生沉淀。之后弃去上清液,管底剩余沉淀物就是RNA了。


04

乙醇洗涤

加入75%乙醇溶液,RNA不溶于乙醇。残留的异丙醇和杂质却可溶于乙醇溶液中,再放入离心机沉淀RNA。残留的异丙醇和杂质却可溶于乙醇溶液中,再放入离心机沉淀RNA。晾干,弃去上清后,离心管置于室温中2-5分钟,待乙醇发挥干燥。



05

DEPC水溶解

DEPC(Diethyl pyrocarbonate)为焦碳酸二乙酯,它能够破环RNase的活性,加入DEPC水溶解后就可以得到纯RNA溶液了。


03

 病毒RNA逆转录成cDNA

这里先介绍下RNA和DNA的组成结构。


RNA也就是核糖核酸(Ribonucleic acid),DNA也就是脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid),核糖核酸的基本组成单位为核糖核苷酸(Nucleotide),由磷酸(Phosphate)核糖(Ribose)碱基(Base)三个部分构成。


脱氧核糖核酸的基本组成单位为脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleotide),由磷酸(Phosphate)脱氧核糖(Deoxyribose)碱基(Base)三个部分组成。


核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸之间的区别在与脱氧核糖少了一个氧原子。

核糖核苷酸根据碱基的不同分为鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胞嘧啶C、尿嘧啶U四种核酸核苷酸。同样脱氧核糖核苷酸根据碱基的不同分为鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胞嘧啶C和胸腺嘧啶T,四送脱氧核糖核苷酸。

RNA就是由这四种核糖核苷酸组合而成长条单链状分子,其结合方式通过磷酸二酯键脱水缩合而成,

不同的核糖核苷酸排列序列构成了不一样的RNA。


比如说这是上海市公共卫生临床中心全球最早公布的新型冠状病毒全基因组序列(GenBank:MN908947),其中A代表腺嘌呤核糖核苷酸,T代表尿嘧啶核糖核苷酸,G代表鸟嘌呤核糖核苷酸,C代表胞嘧啶核糖核苷酸。基因组序列全长29903个核糖核苷酸(nt)。这就是新型冠状病毒RNA了。

因为RNA为单链结构,容易降解,所以先逆转录成更稳定的双联cDNA。


首先加入核酸检测试剂盒中的逆转录酶Oligo(dT)引物,dNTP,根据碱基G与C,和A与T、A与U互补配对原则。

Oligo(dT)引物与病毒RNA 3’ 端相结合,逆转录酶在此结合处开始,以RNA为模板,沿着5’到3’端合成酶互补的DNA链,即cDNA。


04

PCR扩增

PCR扩增(探针法)就是以cDNA某一高度保守基因序列区域为检测靶标,通过PCR扩增,使这段靶标数量呈指数级式增加。扩增的同时,产生强度与靶标数量对应的荧光信号。

通过检测荧光信号来确定样本中是否有病毒核酸。

比如说这是中国疾病预防控制中心推荐选用的新型冠状病毒的检测靶标。

核壳蛋白(nucleoprotein)N基因区域。全长99个碱基对(bp)与之对应的正向引物(F)、反向引物(R)、荧光探针(P),同时还需加入DNA聚合酶dNTP。

PCR聚合酶链式反应,包括高温变性、低温退火、中温延伸,三个步骤。

高温变性阶段,加热至94-98℃,并保持20-30s,使DNA双链打开。


低温退火阶段:温度50-65℃,并保持20-40s,此时,引物和探针通过碱基互补配对与对单链结合,此时,引物和探针通过碱基互补配对与单链结合。


探针的5’端存在于一个荧光基团FAM 3’ 端存在于一个淬灭基团TAMRA。当荧光基团和淬灭基团距离很近时(7-10nm),荧光基团所发出的荧光会被淬灭基团吸收,所以探针完整存在时,荧光基团并不会发出荧光。


中温延伸阶段:加热至75-80℃,并保持120s,聚合酶在引物结合处开始沿着5’端到3’端合成碱基互补的DNA链,由于DNA聚合酶具有核酸外切酶活性,遭遇到探针时将其从模板上切割下来,使荧光基团与淬灭基团分离,进而产生荧光信号,代表一条子链的产生。

继续循环,高温变性-打开双链,低温退火-引物探针结合,中温延伸-合成双链的步骤。

PCR检测仪实时检测记录荧光信号值,并绘制循环数-荧光信号值扩增曲线,横坐标代表循环数(cycle)纵坐标代表荧光强度(Rn)。


05

 结果分析

以第3到第15个循环的荧光信号强度的标准偏差的十倍设定为荧光信号的阈值。阈值线与扩增曲线产生交点,交点对应的横坐标为Ct值。Ct值的含义代表荧光信号强度达到阈值时所经历的循环数。

结果判断如下:


不存在Ct值,阴性

Ct值>40,阴性

Ct值<37,阳性

Ct值在37-40之间,建议重复实验。

通常做完以上所有工作,需要4-6小时。

我有话说......