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液体活检ctDNA标准品,超声和酶切知多少?

归去来兮 2021-3-29 77人围观 技术


来源:基因谷


随着循环肿瘤DNA(ctDNA)技术的飞速发展,应用ctDNA检测MRD已经成为当前的热点。并且基于ctDNA的研究也可以促进下一代新药研发及挖掘新的治疗策略。


目前可用于检测ctDNA中肿瘤相关突变的技术有高通量测序(NGS)、数字PCR(dPCR)、突变阻滞系统(ARMS)等。虽然以上方法较以往检测技术灵敏度有了较大改善,但由于ctDNA在血浆中的绝对含量以及相对含量极低,使得稀有突变和突变百分比较低的突变检测仍具有较大的挑战。


同时,在以上方法的应用过程中,不同实验室的检测情况可能受到以下因素的影响:文库构建时产品的偏倚、背景噪音、覆盖不足以及PCR扩增产物交叉污染等。为了保证实验室ctDNA突变检测的准确性,亟需包含多种已知突变的ctDNA标准品比较和评估实验室之间的检测能力。


ctDNA标准品的制备中,其中一个关键环节是DNA的剪切目前最主要的方法是机械法(最常见的是超声法)和酶切法获得片段化的DNA,二者实际使用中各具优势。





超声打断

超声打断是最常见的DNA片段化方式。超声破碎仪,如Diagenode公司的Megaruptor®、Bioruptor®和Bioruptor®Pico,通过超声空化(cavitation)效应来剪切DNA,即液体在高频率的脉冲拍击下,就会产生无数的高压点和低压点,也就形成所谓的空洞,无数的空洞只保持毫秒级时间又被不断形成的空洞挤爆掉,在这个过程中液体内形成超强的微观爆炸力,这种作用力可以破碎细胞,降解蛋白质,更进一步可以剪切核酸。空化的过程中产生并随后破坏了气泡,产生了小而均匀的DNA片段,然后对从这个过程中获得的剪切DNA进行分析,以确保获得最佳片段大小。

超声法优势在于该方法将DNA暴露于均匀的超声爆发中会导致无偏剪切,从而产生高产量的均匀大小的双链DNA。此外,超声法操作方便,样品损失少,处理速度快,有利于分离纯化,具有良好的通透性,易于实现连续化、自动化,样品处理量大,转化率高等优点。




酶切打断

酶切法打断是利用片段化酶对基因组DNA进行随机打断,和分子克隆中常用的限制性内切酶不同,用于DNA打断的片段化酶并不识别特异的酶切位点,而是对DNA进行随机地、非特异地切割。通过酶切法将细胞系中的非核小体DNA进行消化、纯化得到的ctDNA,能够模拟ctDNA形成的真实过程。

酶切法显著的特点是比较温和,并且能够更好的保留DNA完整性。和超声法打断相比,酶切法能更真实的模拟真实的临床样本的片段分布,且不需要超声打断使用专门的仪器和耗材。另一方面,酶切法中由于酶的特点,得到的DNA片段化产品的末端可能有一定的偏向性,还可能因为引入的酶影响ctDNA的质量。




超声or酶切

通过ddPCR对等位基因频率分别为0.1%或5%的3个基因中进行检测,发现不论超声法还是酶切法,AF均在可接受范围内,证实两种方法制备ctDNA标准品的对临床样本均具有高度替换性。

表:ddPCR QC分析3个突变在0.1%或5%变异AF

在片段分布上,分别用超声法和酶切法两种方法来制备的ctDNA标准品,与真实的临床样本进行对比,对比结果如下:

图1:菁良超声法ctDNA标准品与天然cfDNA比较


图2:菁良酶切法ctDNA标准品与天然cfDNA比较

从上述结果比较可以看出,在片段分布上,酶切法片段化产生的ctDNA与真实的临床样本更为接近。而在剪切效率、剪切成本以及得到的ctDNA质量等方面,超声法优于酶切法。


因此不管酶切法处理还是超声打断,虽然各具特点,用户也可以根据实际需求选择打断方法,但都不影响菁良最终提供的ctDNA标准品质量。


不论是超声法还是酶切法制备的ctDNA标准品,其可最大程度模拟患者样本,助于开发、优化、监测和控制检测的准确性。


这些标准品包含一系列关键癌症基因中常用突变位点,产品平均片段分布在160bp左右,最大程度接近真实血浆ctDNA片段分布。


 本文编辑:乐乐高

来自: 基因谷
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