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蛋白浓度的正确检测方法,你真的get吗?

归去来兮 2021-3-18 95人围观 技术


对很多人来说,检测蛋白质的浓度实在不是多困难的实验。但有时我们也不能太过自信,因为即使最简单的方法都有其复杂的机理。为了帮助大家选择正确并且简单的方法测定蛋白质的浓度,小编在这里简单介绍下几种常用的蛋白质含量测定方法的原理及注意事项。


蛋白浓度检测方法

1、双缩脲法

检测原理:双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物,在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物,此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键,在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物(540nm)。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比。

2、Lowry法

检测原理:Lowry法是双缩脲法与福林酚法的结合与发展。Lowry法的包括两步反应,第一步是在碱性条件下,双缩脲试剂(碱性铜试剂),可与蛋白质中的肽键其显色反应,生成蛋白质-铜络合物;第二步是此络合物将Folin试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)还原成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应,颜色深浅与蛋白质含量成正比。

3、BCA法

检测原理:BCA与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿,即BCA工作试剂。在碱性条件下,BCA与蛋白质结合时,蛋白质将Cu2+还原为Cu+,工作试剂由原来的苹果绿色变为紫蓝色络合物。562nm下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

4、Bradford法

检测原理:考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质―染料结合的原理,定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250染料具有红色和青涩两种色调、在酸性溶液中游离状态下为棕红色,当它通过疏水作用与蛋白质结合后变成蓝色,使染料的最大吸收峰的位置,由465nm变为595nm,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

5、紫外分光光度法

检测原理:蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共轭双键,因此,蛋白质具有吸收紫外光的性质,其最大吸收峰位于280nm附近。在最大吸收波长处,吸光度与蛋白质溶液的浓度服从郎伯-比尔定律。

6、磺基水杨酸法

检测原理:蛋白质为两性物质,在酸性环境中带正电荷,而磺基水杨酸根带负电,正好与蛋白质结合沉淀,显示液体中有蛋白存在。该方法是以浊度为变数测定蛋白质含量的,蛋白质浓度与浊度成正比。


方法比较



 

本文编辑:乐乐高

来自: 索莱宝
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