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核酸检测FAM等荧光通道有什么区别,内标基因有什么用?

归去来兮 2021-3-18 607人围观 技术


作者 | 古远波

单位 | 阳春市中医院



随着全国加大新冠核酸检测能力建设,越来越多的检验人加入核酸检测队伍。在通过理论培训和现场考核后,我也成为核酸检测人员的一分子。


今年一月我们医院核酸实验室建成、备案验收,我随即进入核酸检测实战。虽说之前参加过实操培训,工程师也做了岗前培训,但是对PCR仪的了解,还是停留在基本操作,缺乏对机器的了解。


就拿我们实验室PCR仪来说,仪器荧光通道里FAM通道、VIC通道、Cy5通道到底是有什么区别,内标基因又是什么,有什么用?这些说明书上都是没有的。


带着一半责任感,一半好奇心,我把有关它们的知识点归纳如下:


1
荧光通道的区别


荧光定量Rt-PCR技术自1996年美国Applied Biosystems公司推出,技术发展由单一的染料染色法到特异性更高的探针法,从只能检测单一波长到可以检测多种波长光源被广泛使用的多重PCR技术。


而FAM通道、VIC通道、Cy5通道等是实现多重PCR在TaqMan荧光探针连接相应的激发荧光基团FAM、VIC、Cy5。常见的激发荧光基团除了以上三种,还有TET、HEX、JOE、ROX等。



以上只是常用的荧光基团,至于PCR仪上会选什么基团,除了知识产权会在不同公司外,主要还是考虑减少基团之间相互干扰。


因为荧光基团波长会有部分重叠。比如在某些仪器有HEX通道,而你使用的扩增试剂没有相应的荧光基团。那么波长相近的光就会被HEX通道检测到,从而影响荧光曲线。


/图片来自“生工生物”公众号


有激发基团就会有淬灭基团,淬灭基团的作用就是通过物理或化学作用使相应的荧光基团荧光淬灭。常用的淬灭基团有BHQ系列、TAMRA、DABCYL等。


淬灭基团

中文名称

BHQ-1

BHQ-1羧酸

BHQ-2

BHQ-2羧酸

BHQ-3

BHQ-3羧酸

TAMRA

羧基四甲基罗丹明

DABCYL

4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸


不同的试剂生产商会选择不同的荧光基团及淬灭基团。以我们科室使用的新型冠状病毒2019-nCov核酸检测试剂来说,报告荧光基团是FAM、VIC、Cy5,淬灭基团FAM、VIC选择是BHQ1,Cy5选择是BHQ2。


荧光通道的分配是FAM通道检测N基因、VIC通道检测ORF1ab,Cy5通道检测内标基因。看了以上信息,荧光通道的区别简单地说就是用不同荧光基团连接荧光探针用于检测不同的基因。


/图片信息来自蒋析文、朱小亚、范建、刘悦老师在“临床实验室”公众号文章


2
什么是内标基因


为了降低假阴性的出现,在核酸检测试剂加入内标基因的检测,通过检测内标基因,来质控采样含量、核酸提取、核酸扩增过程。内标基因也称管家基因,通常选择在生物体各类细胞都能表达的基因。以下归纳了几种常用的内标基因。


部分常用的内标基因

中文名称

RNasn P

核糖核酸酶P

GAPDH

甘油醛-3-磷酸脱氢酶

B2M

人类B2M内参引物

18sRNA

核糖体RNA

TBP

TATA结合蛋白(转录因子TFⅡD的组分之一)

β-actin

肌动蛋白(细胞的重要骨架蛋白)

HPRT

次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶


内标基因虽然可以质控包括采样检测整个流程,但它的高表达性,也不能保证采样的准确性,想要采集合格的鼻咽试子还得规范的操作规程和技术规范。只有高质量的标本,内标基因才能发挥其流程质控的作用。


以上就是关于荧光通道、内标基因知识点的归纳。希望对大家有所帮助,因本人归纳水平有限,难免归纳得不够全面,望各路大神们批评指正。


END
来自: 检验医学 | 作者:古远波
我有话说......