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罗阳教授:生物分子检测技术前沿

归去来兮 2021-3-3 107人围观 医学

上一期前沿报道推出的是府伟灵教授关于microRNAs与外泌体检测新技术。今天,检验君将延续上期的内容,介绍分子生物检测领域中另一位大咖——重庆大学医学院罗阳教授关于生物分子检测新技术的最新前沿报道。


碳纳米迷宫用于生物分子的超灵敏检测


准确可靠地测定痕量生物分子在阐明各种生理和病理过程中起着关键作用,尽管近几十年来已经提出了不少超灵敏生物传感策略,但一些生物分子在复杂标本中含量极低,检测仍然具有挑战性。


近日,重庆大学医学院罗阳教授团队及重庆大学生物工程学院侯长军教授、霍丹群教授团队整合了三维石墨烯片阵列和三维DNA四面体(DNA-T)固定化的优点,开发出一种三维碳纳米迷宫(CAM)电极,可用于核酸、蛋白质和细胞外囊泡等痕量生物分子超灵敏地检测。该研究以后封面文章发表在《Advanced Functional Materials》



该CAM电极由交错的碳纤维阵列组成,并在其上原位垂直生长交叉的石墨烯片,从而实现痕量分子的局部限制以提高分子杂交效率。自组装DNA四面体阵列采用刚性空间构象,以确保固定化生物探针的可控排列,提高分析灵敏度和重现性。


此外,研究小组测试了该电极在微量循环中miRNA测定分析能力,在检测microRNA-155验证实验中,实现了0.1aM至100nM的线性范围和0.023aM(23zM)的超高灵敏度。其灵敏度比传统检测方法高出几个数量级。在最佳参数下,该电极在临床标本检测过程中与实时定量聚合酶链反应具有高度一致性。


CAM传感器具有前所未有的高灵敏度可归因于以下几点:①具有出色电导率的CAM电极的三维纳米迷宫结构可有效改善电化学性能,为金纳米粒子提供较大的有效沉积表面积和探针固定;②可控三维DNA-T探针底物确保了探针阵列的刚性空间构象,在溶液条件下提高了靶标与固定探针之间杂交的效率和速率;③三维纳米迷宫结构所产生的“纳米限制效应”使微量生物分子局部化,并将这些靶点推入分离的细胞中,增加靶点与固定在CAM电极上的探针更加有效的杂交机会。


研究小组表示,与传统电化学生物传感器相比,CAM生物传感器表现出优异的稳定性和重现性,可作为环境、化学、生物和医疗保健领域的通用工具。


文章链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202006521



高保真纳米探针用于小细胞外囊泡原位检测

近年来,直径为30~200nm的外泌体样小细胞外囊泡(sEVs)内的各种microRNA受到了广泛关注。与血液中循环miRNA相比,sEVs内miRNA水平变化更能反映机体内生理病理状态,可以作为一种新型的液体活检生物标志物。


日前,重庆大学医学院罗阳教授团队与重庆大学生物工程学院王贵学教授团队联合开发了一种原位sEVs内miRNA检测新方法,通过设计不破坏sEVs结构、有效进入sEVs胞内而不被酶降解的DNA四面体探针(fLIGHT探针),实现miRNA高特异原位捕捉和定量检测。该研究作为封面文章发表在《Small》



该探针尺寸为5.4~8.0nm,结合发卡探针实现靶标miRNA的互补,分子信标的茎环结构和各荧光基团间的发光效应,直接实现sEVs内miRNA分子表达丰度的检测,其检测限为45.4fM。


该探针能够保持几何形状稳定的同时具有良好的穿透力,为了验证探究是否能达到无损进入sEVs,研究人员构建蛋白芯片进行验证,发现该探针能够保证sEVs膜完整的同时进入sEVs,实现囊泡内miRNA的检测。


此外,通过检测临床非小细胞肺癌患者血浆sEVs内miR-21实验,发现该探针可显著区分肺癌患者和正常人血浆sEVs内miRNA丰度,与传统方法RT-qPCR具有良好的一致性。


该研究开发了一种sEVs内miRNA分子可视化检测技术平台,通过改变分子信标探针设计即可以实现对各种靶分子的检测,这对研究sEVs与细胞相互作用规律,阐明sEVs内生物分子调控肿瘤发生发展等方面具有重要意义。


文章链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202002800



三维石墨烯阵列DNA传感芯片快速、动态检测microRNA


近年来,microRNA(miRNA)作为非侵入性诊断生物标志物具有巨大的潜力,已成为重要的肿瘤标志物,其精准检测对于生物医学研究、疾病诊断和治疗具有重要意义。如何完成对血液中痕量miRNA快速、高灵敏检测,成为亟待解决的问题。


近日,重庆大学医学院罗阳教授团队及重庆大学生物工程学院侯长军教授、霍丹群教授团队开发了一种便携可抛式三维石墨烯阵列DNA传感芯片,可用于miRNAs的高灵敏度、动态检测分析。该研究结果发表在《Small》



研究小组以柔性导电石墨基纤维膜(CP)作为导电基底芯片通过射频等离子体化学气相沉积(RF-PECVD)构建了石墨烯阵列芯片,并结合酶信号放大技术构建了双链特异性核酸酶(DSN)耦合的石墨烯阵列/金纳米粒子(GNAs/AuNPs)DNA电路芯片,可实现血液中痕量miRNA的动态、高灵敏度分析检测。


该芯片采用了RF-PECVD原位调控构建具有垂直三维结构的纳米电极,获得具有大比表面积、良好生物相容性、丰富离子扩散通道和反应活性位点的传感界面,增加了靶标miRNA与石墨烯阵列上固定的探针之间来回碰撞的频率,从而提高有效杂交的机会,显著提高了传感器的灵敏度。


利用DSN能够选择性酶切DNA-RNA双链中的DNA,而对单链RNA核酸分子几乎没有作用的特性,建立信号放大策略。以二茂铁(Fc)、亚甲基(MB)为电活性标记物,实现对miR-21的动态分析检测。


研究人员表示,该传感芯片可实现血液中痕量miRNA快速、灵敏的动态分析检测,且操作简便、检测成本低,易于大批量生产和大范围推广应用。对于临床血液样本中微痕量核酸分子的高灵敏分析检测和POCT有着重要的应用价值和一定指导意义。


文章链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202001416



细胞外囊泡MicroRNA的高特异性检测技术


细胞外囊泡(EV)是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的囊泡状小体,在细胞间通讯中发挥重要作用,能将多种功能分子包括miRNA转移至受体细胞。EV衍生的miRNA比血浆循环中miRNA更加丰富,也让越来越多的研究者开始探索miRNA快速可靠的检测方法。


日前,重庆大学医学院罗阳教授课题组利用恒温扩增技术(RCA)及CRISPR的特点,构建了一种新型恒温传感器(RACE),实现了对于胞外囊泡miRNA的准确以及多重检测。该研究成果发表在自然指数期刊《Analytical Chemistry》



该方法通过设计特殊序列的线性模板,在miRNA以及高保真连接酶存在的情况实现线性模板的环化,其中miRNA也可以作为延伸的引物,在T4连接酶、phi29聚合酶的作用下进行滚环扩增,产生多重重复序列,加入荧光淬灭的探针与重复序列结合,再将sgRNA-Cas9加入其中,通过识别重复序列上的PAM以及互补序列,实现探针切割以及信号的释放,构成“turn-on”类型的荧光传感器。


随后选择miRNA-21作为模板验证该传感器的性能,结果显示该传感器的检测线性范围1pM-10nM,通过制作标准曲线得出检测限为90fM。此外,通过在同一体系中加入多种环状模板分别识别不同的miRNA,扩增产物与带有不同荧光基团的探针进行结合,同时监控多种荧光信号,从而实现对miRNA的多重检测。


研究人员表示,该传感器是一种在复杂样品环境中具有高度特异性的多靶点、高灵敏度的等温核酸检测技术,多重检测方法也为胞外囊泡内miRNA的检测提供了新技术,可作为现场部署和便携式设备用于有效的临床诊断或紧急医疗辅助。


文章链接:

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.9b04814



近红外光激活的纳米探针对活体细胞进行时空可控的MicroRNA成像


分子成像技术用于动态监测miRNA在各种疾病诊断和治疗中起重要作用。目前,已经开发出许多在活细胞中进行原位miRNA成像的方法,但这些技术都不可避免地受到与不可控激活相关的限制,造成细胞间背景信号显着增加,影响成像效果。


日前,重庆大学医学院罗阳教授研究团队陆军军医大学府伟灵教授团队提出了一种近红外(NIR)光激活的纳米探针,用于活细胞中高灵敏度的原位miRNA成像,同时消除不利细胞间分子成像背景,显着提高其成像效率。该研究结果发表在《ACS Applied Materials & Interfaces》



该研究提出的NIR探针,可用于活细胞miRNA成像,其灵敏度通过真空催化发夹组件(CHA)用于细胞内miRNA等温扩增而得到保证。近红外-紫外上转换纳米颗粒(UCNPs)将近红外转换为紫外光,以避免紫外光对组织的潜在伤害以及组织渗透性差。


利用具有紫外光响应结构的PC键,在紫外光照射下作为一个“开关”来控制DNA哑铃结构探针的“开”和“关”状态。通过将紫外激活的CHA与UCNPs组装在一起,构建了具有PC分子开关的近红外激活纳米探针。


此外,验证实验中,研究人员选择在各种类型癌症如肾细胞癌、乳腺癌、胶质瘤和膀胱癌中过表达而被视为一个可能治疗靶点的microRNA-21(miR-21)作模型,验证该分析方法的可行性。从活细胞成像特征来看,该纳米探针在HeLa细胞和其他细胞系中miR-21的动态成像结果与qRT-PCR结果高度一致。


研究人员表示,该研究所提出的近红外光激活miRNA成像策略将为生物分析技术的设计提供一个全新的思路,并能帮助人类诊断各种疾病,特别是癌症。


文章链接:

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.0c10962


来自: 检验医学 | 作者:检验君
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