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常用分子诊断技术在新冠病毒检测中的应用价值

面气灵 2020-2-20 721人围观 技术



2019-nCoV是一种RNA病毒,主要通过飞沫和接触传播,具有极强的传染性。准确、及时的诊断和鉴别诊断技术对于新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia,NCP)治疗和疫情的控制尤为重要。在抗击NCP的战役中,众多研究机构和企业应用实时荧光RT-PCR、基因测序、等温扩增、核酸POCT等病原体核酸检测技术,研究开发了一系列应用于NCP筛查、诊断、鉴别诊断及病毒变异监测的适用技术和产品。实时荧光RT-PCR和基因测序技术被列入国家卫健委NCP诊疗规范,是确诊2019-nCoV感染的重要病原学证据。国家药监局为防控疫情开放了特别审批通道,已批准首批6家企业的实时荧光RT-PCR产品和一个基因测序产品上市,为NCP的临床确诊提供了有力的武器。本文简要介绍几种常用核酸检测方法在该病毒核酸检测中的应用情况。


2019新型冠状病毒(2019 Novel coronavirus,2019-nCoV)属于冠状病毒科,β冠状病毒属,于2019年12月底在我国武汉被发现。该病毒具有包膜,颗粒呈圆形或椭圆形,常为多形性,直径60~140nm,为正链RNA病毒,是基因组序列最长的病毒之一,基因组序列全长29 847bp,基因特征与2013年爆发的SARSr-CoV和MERSr-CoV存在明显区别。研究显示,2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒同源性达85%以上[1-2]。

2019-nCoV具有极强的传染性,主要经呼吸道飞沫传播(喷嚏、咳嗽)和接触传染,主要引起人类呼吸系统感染,感染者常出现发热、乏力、干咳,逐渐出现呼吸困难等症状,多数患者预后良好,部分患者起病症状轻微,无明显发热,严重者出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒及出凝血功能障碍等症状,病情危重者可导致死亡[2]。 2019-nCoV是第7个已报导可感染人的冠状病毒,其余6个分别为HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63,HCoV-HKU1及MERS-HCoV。其中HCoV-229E 和HCoV-NL63属于α属冠状病毒,HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV与2019-nCoV均为β属冠状病毒。

核酸检测是临床病原学诊断的常用方法,具有灵敏高、特异性强等优点。多种核酸检测技术已被应用于2019-nCoV感染的临床诊断,本文就几种常见的核酸检测技术在2019-nCoV检测中的应用情况进行概述。


1

实时荧光RT-PCR技术


实时荧光RT-PCR是指在普通PCR反应体系中加入荧光探针或荧光染料,通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。该技术特异性强、灵敏度高、检测周期短、可定量检测,而且检测过程封闭,较好地解决了PCR污染问题,目前已在科学研究及临床疾病诊断领域得到广泛应用。

2019年12月武汉肺炎疫情出现的初期,国家疾病预防控制中心迅速响应,对新型冠状病毒序列进行测序确认,选择该基因中具有特异而又稳定的2-3个基因序列,公布了其实时荧光RT-PCR检测引物探针序列(表1)(http://nmdc.cn/#/nCoV)。欧盟疾病预防控制中心也快速建立了实时荧光RT-PCR体系用于该病毒的检测[3]。美国疾病预防控制中心(centers for disease control and prevention,CDC)于1月24日公开发布实时荧光RT-PCR检测方案。我国已将实时荧光RT-PCR技术列入新型冠状病毒肺炎诊疗指南[4]。目前,国内已有6个基于实时荧光RT-PCR技术的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(表2)获得国家药品监督管理局批准,可日产百万以上人份试剂,为冠状病毒感染确诊提供了有力的工具。随着疫情的发展,2020年2月4日,美国食品和药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)授予了美国CDC新型冠状病毒快速检测的紧急使用授权,用于符合CDC新型冠状病毒检测标准患者的诊断[5]。


由于实时荧光RT-PCR技术具有灵敏度高、特异性强、技术体系成熟、试剂开发速度快、仪器的普及率高等优势,成为历次新发传染病临床诊断试剂开发的首选技术。在2019-nCoV基因组序列公布后,实时荧光RT-PCR试剂被快速开发且应用于临床,成为NCP病原学确诊的标准。


然而,王辰院士在回顾实时荧光RT-PCR在武汉的使用情况时说,在临床诊断的病例中,核酸检测阳性仅占30-50%,其检测灵敏度受到很大的质疑。其可能原因主要有以下几点:1、采样时病毒载量过低。以每反应5μL的上样量为例,其理论检测限是1copy/反应,即200copies/mL,当病毒载量低于此浓度时,可能导致假阴性结果的产生;2、采样质量差。肺泡灌洗液和深咳痰液标本少,常见标本类型是鼻咽拭子,标本采集的规范性差从而导致假阴性的产生;3、RNA病毒核酸稳定性较差,易受运输条件、灭活条件和实验耗材的影响;4、试剂盒质量不稳定。应急研发生产的核酸检测试剂盒的关键组分如探针、引物和酶质量有波动,或在加急大量生产过程中生产质检规范不到位,导致试剂盒的质量不稳定。检测敏感性低下使大量疑似病例不能得到病原学确诊,不能及时收治又导致家庭聚集性感染。检测技术手段少,是目前NCP病原学诊断亟待解决的问题。


2

下一代测序技术


下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)具有通量高、信息量大、准确率高等主要优势[6],可对标本中未知病原进行检测鉴定,确认病原体基因组信息,为新发传染病的病原鉴定、复杂危重感染的诊断和鉴别诊断、基因变异等研究提供了有力的手段。在武汉疫情初期,我国疾病控制机构应用基于二代测序的宏基因组学技术,在短时间内完成该病毒相对丰度的鉴定,并获取了全基因组序列,发现其与SARS病毒有79.5%的序列相似性,与蝙蝠冠状病毒有96%的序列相似性,并进一步结合实验发现该病毒感染人类的受体与SARS一致,均为ACE2受体蛋白[7-8]。通过对2019-nCoV和SARS-CoV、bat-SARS-CoV以及一些蝙蝠来源的α、β冠状病毒全基因组序列分析,发现2019-nCoV与bat-SL-CoVZC45属于同一分支,但距离人源的SARS-CoV病毒较远,该研究为2019-nCoV的溯源、临床诊断以及治疗方案制订提供了有力的依据。

英国Oxford Nanopore Technologies公司推出的纳米孔测序仪MinION是目前最便携的三代测序仪,可与计算机连接直接进行使用。MinIon的测序读长长达2.3 Mb,可完成新型冠状病毒的全长测序,无需经过生物信息学的拼接,可快速完成病原体序列的检测及分析,为病毒基因变异的实时监控提供了完整方案[9]。在本次2019-nCoV的防控中,国家疾病预防控制中心利用该技术对9例住院患者的支气管肺泡灌洗液样本和培养分离株进行测序,对感染2019-nCov患者的基因组全长进行分析,提供了可能的病毒来源及细胞结合受体信息,对该病毒的溯源、变异的持续监测及传播能力的监控奠定基础[10]。

值得关注的是,华大基因科技股份有限公司基于联合探针锚定聚合测序法开发的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒及其序列分析软件获得了医疗器械注册证,可用于肺泡灌洗液和咽拭子样本中新型冠状病毒的检测,为宏基因组技术的临床应用开辟了一条途径。虽然该方法由于对实验室环境、装备和人员素质的要求高,耗时长,价格相对昂贵,不一定适合于2019-nCoV的临床常规检测,但基于宏基因组的测序分析技术可用于鉴别2019-nCoV和其它呼吸道病原体的感染,对包括NCP在内的重症、复杂的肺部感染和合并感染的鉴别诊断具有很好的临床应用价值。同时,在大量临床标本中所获得的病毒基因序列数据对后续进行2019-nCoV的病原学、免疫学、流行病学研究具有重大的价值。


3

CE和核酸质谱


毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术[11],具有多分离模式、高分离效率、快速检测、易于调控以及环境污染小等优点[12],目前已被广泛应用于病原微生物检测等领域[13]。毛细管电泳技术在一个反应内可同时对2019-nCoV、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、SARS冠状病毒等其他已知病毒性肺炎、支原体、衣原体肺炎及细菌性肺炎等病原体进行检测,可辅助患者分流、精准治疗,从而减轻医护人员压力、优化医疗资源配置,帮助减轻防控压力。

核酸质谱是近年来基于飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术发展起来的一种新型软电离生物质谱分析技术[14],其设计十分简单和高效。它整合芯片技术的高通量和质谱技术的高灵敏度,无需复杂的生物信息分析,主要应用于已知突变的检测。核酸质谱单个反应可同时进行20~50重PCR扩增,一次完成数十种病原体的检测,具有通量高、操作简单及成本低廉等特点,对于呼吸系统感染的鉴别诊断是非常有效的工具。达瑞生物成功研发了可同时检测2019-nCoV和20种其它常见呼吸道感染病原的核酸质谱试剂盒。


4

等温扩增技术


等温核酸扩增技术,在恒温条件下即可发生扩增,具有快速、高特异性和高灵敏度等特点,对硬件设备要求低,更符合基层医院检测工作的要求。在已有的等温扩增技术中,环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)在临床分子诊断等领域应用较为广泛。该技术利用具有链置换活性的Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶,针对检测靶标6个不同区域设计4条特异引物,在60~65℃恒温条件下对靶标进行特异扩增[20]。与实时荧光RT-PCR技术相比,该技术具有高效快速、设备简单等优点,在病原体现场检测方面具有独特优势。将荧光探针与LAMP结合,其检测性能与实时荧光RT-PCR相当,检测时间更短[21]。尽管等温扩增技术具有检测时间短、对仪器要求低等优点,但由于该技术本身设计难度较高,在临床上尚未得到广泛应用。目前,我国已有多个团队基于该技术完成了2019-nCoV检测试剂的研制,但均未获得医疗器械证书。徐涛院士团队开发的2019-nCoV等温扩增试剂盒可在30min内给出结果,江苏奇天基因团队研制的2019-nCoV核酸等温扩增快速检测试剂盒可在8-15分钟内出结果。


5

核酸POCT技术


床旁检验( Point of care testing,POCT)是在采样现场利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。该技术将核酸提取、扩增与检测的功能模块相整合,并将反应中所需的各试剂预封于检测卡盒中,操作人员仅需将拭子或血液等样本加入,即可在短时间内自动完成核酸扩增、信号收集与结果分析[22]。目前,国内已有多家企业研制了核酸POCT检测仪器和配套检测试剂,其中万孚倍特在其BoxArray全自动多重核酸检测平台上成功开发了病毒快速检测试剂;透景生命推出的新型冠状病毒分子POCT检测试剂可在1-1.5h内完成4个样本的检测;奥然生物已完成新型冠状病毒核酸检测试剂卡盒研制,可一次检测12个样本。核酸POCT检测技术将样本制备及检测整合成一体化检测系统,大大简化样本检测流程、缩短检测时间并有效防止交叉污染,对于在基层医疗机构开展新冠病毒感染的快速筛查具有巨大的价值。国家科技部近日已立项研究可用于快速筛查的核酸POCT产品,相信很快就会改变无POCT产品可用于2019-nCoV检测的现状,改善标本大量积留等待上级CDC检测的被动局面。


6

思考及展望


回顾NCP疫情发生以来核酸检测技术对疫情防控的作用,提出以下思考和展望:

  • 在有条件的医疗机构加强宏基因组检测技术能力,对临床危重/复杂感染、特别是暴发感染的病原学检测中强化宏基因组技术的应用,将有助于早期发现致病病原,预警突发和新发传染病。目前已有许多公司应用基于二代和/或三代测序技术对危重感染病人提供宏基因组检测服务。宏基因组检测技术可快速获得样本中病原体基因组序列甚至基因组全长序列,对危重和复杂感染提供比较全面的病原基因扫描分析,提出辅助诊断和鉴别诊断依据,判断感染病原载量,发现耐药基因并指导临床用药。当然,宏基因组技术尚需优化,以进一步富集病原靶标基因、缩短检测时间、简化检测流程、降低检测成本,使之成为临床常规检验技术。


  • 加强全自动一体化核酸检测技术的研发。对于高传染性病原的检测操作需在二级及以上生物安全实验室进行,检验人员需要全副武装,谨慎操作,工作效率非常低下。在抗NCP疫情的工作中,已有多名检验人员被感染。因此,开发从核酸提取到PCR扩增和检测的全自动、全封闭的检测系统,避免检测者与传染性样本的高频率接触,是提高对高传染性病原检测能力的重要一环。


  • 加速核酸POCT技术应用,提高基层医疗机构的核酸检测能力。在本次疫情中,大量的疑似病例以及医学观察人群需要进行核酸检测,但受限于实时荧光RT-PCR的检测通量、生物安全要求、检测人员专业素质等因素,大量的基层医院无法开展核酸检测,导致大量患者无法及时得到确诊。研究开发简便易用、“标本进结果出”的核酸POCT技术和装备,解决大量基层医疗机构无法开展核酸检测的问题也是迫在眉睫。


  • 加强鉴别诊断技术的研究,提高快速明确诊断和鉴别诊断相似临床表现疾病的能力。发展如核酸质谱和毛细管电泳(CE)等中通量和低成本的鉴别诊断技术,开发能同时检测数十种病原体的检测技术和配套试剂。肺炎相关病原体种类繁多(2019-nCoV、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、SARS冠状病毒、支原体及衣原体等),依靠实时荧光RT-PCR分别进行检测费时费力,亟需中通量检测技术以满足NCP和非NCP鉴别诊断的需求。


参考文献略

来自: 检验视界王
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