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【专家论坛】高密度和低密度脂蛋白胆固醇测定参考系统现状及有关问题 ...

面气灵 2019-9-23 102人围观 杂谈


文章来源:中华检验医学杂志,2019,42(8): 602-606

作者:董军 陈文祥



摘要
血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高是心血管病的重要危险因素;HDL-C和LDL-C测定结果准确、可比,是心血管病防治工作的基本要求。HDL-C和LDL-C准确测定需要可靠的参考系统,包括参考方法、参考物质和标准化计划。美国疾病控制和预防中心(CDC)的参考方法为超速离心/化学沉淀/AK胆固醇测定法,又称β-定量法,此法样本用量大、技术要求高、耗时、低效,限制了其在标准化中的应用。基于相同分离原理的小体积β-定量法样本用量少、操作简便、通量高,在一定程度上解决了CDC参考方法的问题,但仍对样本基质敏感。应用血清参考物质校准或评价常规方法需要考察其互通性问题;应用参考方法评价LDL-C常规方法需要使用新鲜血清。研制具有互通性的参考物质,以及基于超速离心分离和精密胆固醇测定、对样本基质不敏感的参考方法是脂蛋白测定标准化的重要任务。


血清高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)胆固醇(HDL-C)降低和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)胆固醇(LDL-C)升高是动脉粥样硬化性心血管病(cardiovascular diseases,CVD)的重要危险因素[1]HDL-C和LDL-C测定结果准确,具有横向和纵向可比性,在CVD风险评估、治疗决策制定以及疗效评价中起着重要作用[2]早在1995年,美国国家胆固醇教育计划(NCEP)血脂测定标准化专家组(LSP)就提出HDL-C和LDL-C分析质量标准[3,4],要求HDL-C和LDL-C测定偏差分别小于5%和4%,无论临床实验室使用何种测定方法,都应达到此要求。目前临床HDL-C和LDL-C测定普遍采用匀相法(直接法),此类方法样本用量少,不需沉淀离心等处理,可用于自动生化分析仪测定,因此在国内外得到迅速发展和应用。但是,有些方法在追求和实现简便性的同时,在一定程度上牺牲了方法的特异性和准确性。目前HDL-C和LDL-C测定仍存在偏差较大的问题,有些试剂尚不能满足NCEP分析质量标准和心血管病防治工作的要求[5,6,7]提高和保证脂蛋白测定的准确性,使不同方法、不同厂家、不同实验室的检验结果具有可比性,需要可靠的参考系统并开展标准化工作[8]参考系统包括参考方法和参考物质,建立准确、可靠的参考方法是HDL-C和LDL-C测定标准化的关键内容[9]


一、HDL-C和LDL-C测定参考方法
脂蛋白(lipoprotein)是一类由富含胆固醇脂、甘油三酯(TG)的疏水性内核和由蛋白质、磷脂、胆固醇等组成的外壳构成的球状微粒。脂蛋白可以根据其颗粒大小、密度、漂浮常数、电泳迁移速率等进行分离,根据不同的分离方法(如超速离心、电泳等)进行定义,其中最主要也最被广泛接受的分类方式是基于脂蛋白密度的超速离心法。超速离心将脂蛋白分为乳糜微粒(d<0.95 g/ml)、极低密度脂蛋白(d∈0.95~1.006 g/ml)、中间密度脂蛋白(d∈1.006~1.019 g/ml)、LDL(d∈1.019~1.063 g/ml)、HDL(d∈1.063~1.21 g/ml)以及脂蛋白(a)[apo(a)](d∈1.050~1.110 g/ml)。HDL-C和LDL-C测定的是HDL和LDL颗粒中的总胆固醇,包括游离胆固醇和胆固醇酯。由于不同脂蛋白之间没有明确的界限,有些还存在一定的重叠,准确定义和测定均非常困难。例如,超速离心分离LDL一般在d=1.006 g/ml(血清自身密度)进行,在此密度范围内LDL(1.006~1.063 g/ml)不仅包含了部分中间密度脂蛋白(IDL)、部分与LDL功能不同的Lp(a),还可能包含功能和组成与LDL完全不同的含apoE的HDL。建立可靠的参考方法的前提是待测物有明确的定义,如血清总胆固醇、总甘油等小分子代谢物。而HDL和LDL由于大小和组成的高度异质性,要准确定义代表某一物理特征和功能特性的HDL或LDL几乎是不可能的,所以HDL-C和LDL-C的参考方法需要根据其分离手段进行规定,而基于某种特定分离方法的"金标准"可能无法通过其他的分离或测定方法而实现。

(一)美国CDC的β-定量法
国际上被广泛认可的HDL-C和LDL-C测定参考方法是美国疾病控制与预防中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)的超速离心-肝素锰沉淀-AK胆固醇测定法,也称为β-定量法[10]。它基于美国20世纪70年代的(Lipid Research Clinics Program,LRC)计划中的脂蛋白测定法,将超速离心温度从10 ℃调整为18 ℃。方法如下:(1)用移液管精密吸取5 ml血清于超速离心管中,在密度d=1.006 g/ml(血清本身的密度)下进行超速离心18 ℃,105 000×g,18 h,在此条件下密度较低的VLDL和乳糜微粒(d<1.006 g/ml)漂浮到离心管的顶部,底部组分(BF)主要为HDL和LDL,以及可能存在的部分IDL和Lp(a);(2)在离心管中液体的中间位置切割离心管,去除上部离心管和液体,定量收集底部组分到5 ml容量瓶并用d=1.006 g/ml密度液定容(至初始体积),混匀,为BF;(3)用肝素-锰离子试剂沉淀BF中的β-脂蛋白,AK法(TC测定参考方法)测定底部组分和上清液中的胆固醇,分别为BF-C和HDL-C,从BFC中减去HDLC即为LDL-C,LDL-C中包括Lp(a)和IDL-C。此方法的关键在于离心去除了富含TG的VLDL组分,所以测定结果不受高TG的影响。此参考方法在一年内测定HDL-C和LDL-C的不精密度(CV)可以达到1.4%和1.3%。NCEP推荐该法为HDL-C和LDLC的参考方法,不仅因为此法的准确性能够得到验证,更主要的是此法是过去几十年中绝大多数重要流行病学/人群研究中所使用的参考血清的定值方法,在国际血脂标准化计划中发挥了重要的作用;采用此方法为准确性基础,可以使患者的分类与NCEP建议的医学决定水平一致。此法也是国际临床化学会联合溯源委员会(JCTLM)参考方法列表中列出的唯一的HDL-C和LDL-C参考方法(https://www.bipm.org/jctlm/)。但是此方法存在一些明显的问题和不足。首先,样本用量大,方法的应用在很大程度上受到样本量的限制;其次,样品制备过程需要严格的容量操作,包括取样、切割离心管和BF的定量转移,操作繁琐,技术要求很高;第三,由于某些酶(卵磷脂胆固醇酰基转移酶LCAT,胆固醇酯转运蛋白CETP等)的作用,样品制备和超速离心过程本身会造成脂蛋白之间的脂质交换,影响测定结果;第四,HDL的分离采用化学沉淀法,影响因素较多;最后,受超速离心转头的限制,每次实验只能测定12~16份样本。由于国内能够运行此参考方法的实验室极少,影响其在血脂标准化中的作用。对HDL-C测定,CDC建立了一种改良的硫酸葡聚糖沉淀法作为指定比对方法(DCM)[11],DCM省去超速离心过程,直接用硫酸葡聚糖-镁离子试剂沉淀含载脂蛋白B(apoB)的脂蛋白,测定上清HDL-C,对于血清TG<2.26 mmol/L(200 mg/dl)的样本,测定结果与β-定量法相当。DCM由于简便、快速,也被广泛用于CDC血脂标准化计划中。但对于TG高的样本,DCM失去准确性,故临床应用受限,可能会逐渐被弃用。

(二)小体积β-定量法
为了提高β-定量法的可及性、稳健性和分析通量,需要降低样本用量,简化容量操作。CDC在降低该法样本体积方面做了大量研究工作,曾建立样本量为2 ml的HDL-C和LDL-C测定法,但最终未能取代原5 ml方法,因为此样本量几乎是容量操作可以接受的最小体积。为了降低样本用量和分析时间,简化容量操作步骤,提高方法的通量,Cole等[12]建立了两种小体积β-定量法,分别取1和0.23 ml血清进行超速离心,离心后切割离心管,将底部组分重组到初始体积(1和0.23 ml),酶法测定BF-C;HDL-C采用血清直接沉淀β-脂蛋白后用酶法进行测定,计算LDL-C。由于样本体积小,此法取样和超速离心后的BF重组均采用普通加样器量取,变异和偏差较大,精密度和准确度均达不到参考方法的要求。本研究在美国CDC参考方法的基础上,建立了小体积β-定量法[13]:用加样器将0.8 ml血清转移到超速离心管中并用1/10 000天平精密称重离心管和血清,采用T25转子在20 ℃,23 000 r/min(转子半径范围100.4~132.1 mm)超速离心18.5 h,用负压吸引器吸掉离心管中的上部组分;用天平称重含有BF的离心管,往各离心管中加入d=1.006 kg/L的密度液至离心前初始重量,混匀,即为BF;取BF 0.4 ml,用肝素锰沉淀β-脂蛋白,制备HDL,HPLC[14](JCTLM列表中推荐的TC参考方法)同时测定BF-C和HDL-C,BF-C减去HDL-C即为LDL-C,含IDL和Lp(a)。本方法的原理与CDC的β-定量法完全一致,由于采用重量法取样和超离后的BF重组,样本用量小,操作简便、精密度高;使用高容量的Beckmen T25转头,一次实验最多可以测定100份样本。自2012年开始,本实验室作为CDC参考方法网络实验室(CRMLN)成员,用小体积β-定量法参加一年4次(现改为每年2次)的CRMLN网络实验室之间的测量比对,与CDC的β-定量法以及其他国际参考实验室的结果一致,证明了此方法的准确性。但此方法与CDC参考方法一样,仍然存在两方面问题,一是两者均需要超速离心18 h或以上,研究发现血清中HDL和LDL中的胆固醇会发生交换造成脂蛋白胆固醇的变化[15];另外,HDL的制备用化学沉淀法,影响因素多。


(三)全超离法测定HDL-C和LDL-C
各种脂蛋白是基于超速离心法定义的,同时超速离心法也是最可靠的脂蛋白分离方法,因此,多年来一直认为超速离心法分离HDL和LDL(结合精密的胆固醇分析)将是最终的HDL-C和LDL-C参考方法。但此思路至今未能实现,有两个主要原因,一是超速离心中的定量操作困难、繁琐,需要的标本量大;二是部分Lp(a)(d∈1.050~1.110 g/ml)在HDL和LDL密度范围内均有分布,超速离心直接分离HDL和LDL会造成测定偏差。为了实现HDL和LDL的超速离心分离,我们尝试用巯基乙醇(ME)将Lp(a)解离为LDL和apo(a),解离后的Lp(a)的密度分布与LDL一致,而apo(a)离心后沉降在离心管的最底部[16],这样就可以实现HDL和LDL的超速离心分离,分离的HDL不受Lp(a)的影响,Lp(a)包含在LDL内,与目前临床化学的定义一致。方法如下[17]:用自动稀释器将0.05 ml血清与0.8 ml d=1.006 g/ml的密度液混合,采用T25转子在20 ℃,23 000 r/min(转子半径范围100.4~132.1 mm)超速离心18.5 h分离BF(HDL+LDL);将0.05 ml血清与0.8 ml d=1.063 g/ml的密度液(含5 mmol/LME)混合,超速离心分离BF(HDL);离心结束后,用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管,弃去上部离心管和液体,将含BF 1.006(LDL+HDL)和BF1.063ME(HDL)的底部离心管置10 ml试管中,加入十倍体积8.9 mol/LKOH/乙醇(1∶9)进行水解,加入胆固醇内标,用HPLC内标法测定BF胆固醇[14]。此法设计巧妙,ME的使用消除了Lp(a)对HDL的干扰;由于不需要化学沉淀法制备HDL,可以采用稀释样本进行超速离心,样本用量低至0.1 ml;自动稀释器转移样本,操作简便、精密,结果与小体积β-定量法一致[17]。但是,此法的特异性和准确性还需要通过更多的国际标准化计划进行验证。以上研究结果表明,HDL-C和LDL-C参考方法的相关研究较少,目前的参考方法还不十分完善,需在澄清各主要影响因素并对各主要脂蛋白的定义形成统一意见后作进一步改进。

二、HDL-C和LDL-C参考物质和标准化计划

血脂标准化计划是将常规分析与参考系统相联系的过程,有两种主要方式,即应用参考物质和应用参考方法。应用参考物质相对简便,也是最常用的方式。美国国家标准与技术研究所(NIST)研制的3个批次的参考物质1951a、1951b和1951c,每个批次为2个不同浓度水平的冰冻人血清,其HDL-C和LDL-C浓度用美国CDC的β-定量法定值。国家卫建委北京老年医学研究所和卫建委临床检验中心研制的国家一级标准物质GBW09178-09180和GBW09193-09196,以及卫建委临床检验中心每年用于正确度验证的2种浓度水平的质控血清,均用本实验室小体积β-定量法定值。另外美国CDC血脂标准化计划(LSP)和CRMLN中使用的定值血清也是美国CDC研制,β-定量法定值。值得注意的是,参考物质品种有限,在浓度和样品成分(包括可能干扰因素)方面不具备足够的代表性,因而不能有效地鉴定和修正校准以外的分析质量问题,如特异性、线性等。二是有些参考物质的行为与新鲜样品不同,即存在基质效应(没有互通性),用参考物质校准的分析系统分析实际样品时会产生误差。对于小分子代谢物来说,基质效应一般只存在于常规方法,在高度特异的参考方法中一般不表现基质效应问题。但是,我们的研究结果显示,对于HDL-C和LDL-C测定,基质效应不但存在于直接法,基于超速离心的参考方法(特别是LDL-C测定)不但对样本基质敏感,也对血清的冻融非常敏感,提示冻融可能造成血清密度的变化,从而对参考方法测定HDL-C和LDL-C的结果造成影响。Korzun等[18]研究了冰冻血清的互通性问题,指出HDL-C的溯源性应基于几种不同的冰冻血清,单一血清缺乏可靠性;对于LDL-C,冰冻血清可能不具互通性,用于常规方法溯源或不同常规方法间的比对不具备可靠性,与我们的研究结果一致。另一种标准化计划是应用参考方法,即用参考方法和常规方法同时分析足够数量的、有代表性的、分别取自不同个体的实际新鲜样品,是最有效的标准化方式。我们曾应用全超离的方法,评价了国内市场上最常见的HDL-C和LDL-C匀相法试剂[6,7],发现很多试剂存在特异性和准确性问题,结果受脂蛋白组成,特别受TG水平的影响较大。由于血脂试剂厂家的数目远远低于临床实验室,所以针对试剂厂家的标准化计划是提高临床实验室检测质量的有效手段。美国CDC于1989年成立CRMLN,用CDC参考方法,向血脂分析试剂生产厂家提供标准化服务。作为CRMLN网络成员,本实验室用小体积β-定量法参加网络实验室间的测量比对,并为国内外试剂厂家提供溯源认证服务。按照HDL-C和LDL-C溯源程序,厂家用待认证常规系统分析>40个覆盖生理浓度的患者血清,与参考方法的测定结果相对比,评价常规方法的线性、特异性、偏差等。对于HDL-C认证,厂家分析新鲜血清,参考实验室分析冰冻血清;但是对于LDL-C,为避免基质效应的影响,CRMLN要求用新鲜(未冰冻)血清进行参考方法和常规方法之间的比对。


三、HDL-C和LDL-C测定标准化存在的问题
HDL-C和LDL-C的直接法测定广泛应用已经有约30年的历史,但目前不少情况下其测定质量仍不能达到美国NCEP的要求,仍然需要重视和开展标准化工作以满足心血管病预防和临床诊疗的要求。目前HDL-C和LDL-C测定参考方法标本用量大、操作繁琐、难以掌握、使用率低。且无论是参考方法还是直接法都对标本基质敏感,用冰冻参考物质校准的分析系统分析实际样品时可能会产生偏差。最有效的标准化方式是用参考方法与常规方法进行一分为二的样品比对。对于HDL-C,用参考方法与常规方法进行比对时可以使用冰冻血清,但是对于LDL-C,参考方法与常规方法比对时必须使用新鲜血清。试剂厂家应通过参加CRMLN的溯源认证,提高分析质量。临床实验室应首先选择经过认证的分析系统以提高结果的准确性。

综上,目前HDL-C和LDL-C的参考系统还存在着很多问题。在严格规定脂蛋白定义的基础上,研究并建立精密、准确、易于操作、不受样本基质影响的参考方法,以及研制与实际血清样本行为一致的具有互通性(没有基质效应)的参考/质控物质,是脂蛋白测定标准化的重要任务。
来自: 中华检验医学杂志
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