争鸣！HIV感染诊断标准 RNA>5000cp/ml的尴尬

随着化学发光为代表的新一代灵敏的免疫检验技术及以实时荧光PCR为代表的核酸检测技术（NAT）的发展和成熟，WB相比之下变成了检验舞台上一种“古老”的技术。

我们可以联想，在2013年左右，作为经典的HCV抗体确认试剂—Chiron公司的重组免疫印记试剂（RIBA） HCV3.0版不再生产，告别了丙肝诊断的舞台，美国FDA批准的唯一用于验证HCV抗体阳性结果的指标，变成了HCV RNA^[1]。

很快，2014年美国CDC更新了HIV结果报告导则^[2]，流程图里，也使用HIV-1/2抗体鉴别试验（快速试剂）取代了传统WB的位置。两种策略均突出了NAT的重要性，尤其对于急性感染或免疫缺损人群而言，NAT尤为必要，与此同时，抗体确认试验的重要性大大降低。

每天的临床实践经验也告诉我们，WB作为最终的确认试剂有较大局限性。

第一，它并不特异。很多第三代或四代的HIV免疫试剂“低值阳性”结果为“假阳性”结果，例如文献报道，对于HIV感染的低危人群而言，雅培Architect HIV combo试剂（第四代试剂）检验结果低值阳性（S/Co值1.00-15.00之间）均为“假阳性”^[3]，但我们发现不少这样初筛结果的样本送至CDC，回馈“不确定”结果，容易给患者带来不必要的的精神负担，也会影响其进一步的诊治。

第二，它并不敏感。WB检测抗体的灵敏度本身就不及化学发光技术，此外，第四代、第五代化学发光试剂可以同时检测p24抗原、病毒特异性IgG、IgM抗体（表1），而WB一般只能检测IgG抗体，势必会延长检测“窗口期”，漏诊急性感染患者。我们见过化学发光S/Co>500而CDC反馈WB结果“不确定”的病例。

第三，WB的操作复杂耗时，判断结果较为主观，即使经验丰富的技术人员发送结果也难免“压力山大”。

表一：HIV血清学检验试剂的发展史

2018年，我国更新了艾滋病诊治指南，逐渐与国外颁布的指南中的理念接轨，其中突出的一点就是提升了HIV RNA检测的地位，强调HIV核酸定性或定量检测也可作为诊断依据，尤其是对于抗体确认试验结果为“不确定”的患者；也肯定了HIV RNA在早期明确HIV感染方面的重要性，鼓励医院开展HIV核酸检测和结果咨询^[4，5]。

但值得关注的是，该指南中，诊断HIV感染标准之一是，“核酸定性检测阳性或核酸定量大于5000拷贝(cp)/ml”，但并未附相关的参考文献或经验性数据支持5000cp/ml这一阈值的设定。

2019年，由中国CDC牵头修订的《艾滋病和HIV感染诊断》行业标准（WS-293-2019）则继续沿用了该阈值。其设定或是基于检测试点累积的数据（可能也属于“内部数据”）^[6]，或是出于降低NAT“假阳性”结果的考量，但即使如此，5000cp/ml这一阈值仍有待商榷，其循证医学证据可能稍显不足。笔者认为，当前HIV感染，包括急性感染和传播的形势严重，同时，HIV RNA检验试剂的性能较为可靠，应降低诊断HIV感染的RNA阈值，理由如下：

引入HIV RNA的目的之一，就是要避免像WB那样容易产生“不确定”结果而延迟诊断和治疗。但5000cp/ml阈值的设定，同样会人为造成结果“不确定”，影响结果判断，也影响患者诊断和治疗的依从性，因此，可能并非一种高效的卫生经济学策略。再者，低病毒载量结果是一种客观存在。例如，暴露的极早期，HIV刚开始复制，会有短暂的血清低病毒载量期；再如，少数采取HIV暴露前或暴露后预防失败的被测者，血清HIV RNA也会出现极低值，等等。从检验方法角度上看，还可能出现因为检验试剂性能缺陷（如HIV突变引起引物或探针不完全匹配、RNA提纯不完全混入抑制物、PCR体系效率低下等等）而导致的低病毒载量的假象（下面会有详述）——但这些RNA“低值阳性”情形，几乎都可确诊HIV感染。

HIV RNA检测已有成熟的国际标准品作为溯源，基于实时荧光技术的检验试剂也很成熟。下图列举了具有代表性的国内外HIV检测试剂品牌的灵敏度，不管是定性还是定量试剂，其最低检测限（LOD）均远小于5000cp/ml。以赛沛Xpert HIV RNA等为代表的即刻检测（POCT）核酸定量检测试剂，灵敏度也不逊色。与此同时，在血站，具有极高灵敏度的HBV DNA/HCV RNA/HIV RNA三联检测已经广泛开展多年，有效地保障了血液安全；而若在临床设定5000cp/ml的诊断阈值，可能是对现有诊断试剂性能的浪费。传染病诊治指南的制定可建议邀请更多检验技术和体外诊断（IVD）技术专家参与，可能会对关键技术和试剂的临床应用细则形成更好的把控。

如前所述，美国的指南中，并未限定HIV RNA的诊断阈值，建议“阳性”即可诊断HIV感染^[2]。欧洲2014年HIV检验指南中^[7]，倒是建议<1000cp/ml的低载量结果需要结合其他指标综合分析，这可能是出于对RNA检测污染的顾虑，但其引用的3篇报道污染的文献均为2006年及之前，出现污染的试剂为基于信号扩增原理的分支DNA（bDNA）试剂，或基于PCR产物杂交原理的Amplicor试剂，使用这些试剂检测，需开放操作，气溶胶污染的风险大，并且报道的污染案例，假阳性RNA载量都在这些试剂的LOD附近。

而现今这些试剂大都被基于实时荧光PCR技术的试剂所取代，全程实时检测扩增信号，不需要对PCR产物开盖检测，虽然灵敏度得到了很大的提高，LOD一般都在50cp/ml或以下，但气溶胶污染风险却降低。

艾滋病发现越早、治疗越早，越有利于延长生命，其传染性也越受限。这是防控艾滋病的关键。按照2014年艾滋病治疗标准，能享受免费治疗的HIV感染者和艾滋病患者，需CD4细胞数<500个/mm³；而更新的指南不再设置CD4细胞数的“门槛”，发现即治疗，即，确诊即治疗，该理念也开始与国际接轨。新的治疗标准和治疗理念，应以大力宣传，尤其应在高危人群广泛传播。

但设定>5000cp/ml再启动治疗的新“门槛”，谈不上是积极的举措。联想HBV和HCV感染的诊断，欧美和中国的指南均强调使用高灵敏、低检测下限的诊断试剂，核酸“阳性”即启动治疗，该策略对HIV感染者尤为必要，因为及早治疗甚至可能阻断病毒整合入人的基因组，避免形成稳定的病毒库，感染者极大受益。当前HIV RNA检测的周期普遍偏长，特别对于那些样本量少的实验室，出报告可能需要3-5个工作日甚至更久，这也就意味着，对那些RNA阳性但又<5000cp/ml的感染者，若像指南推荐那样需要重新采血复测，他诊断和治疗的时间便被拖延1周甚至更久，以致于感染者可能会因为不愿或不便复测而脱落。

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第一，新指南定义治疗HIV“病毒学失败”的定义是，治疗48周后，HIV RNA>200cp/ml。如果顾虑<5000cp/ml的检测值不准确，那么，200cp/ml的检测准确性也无从谈起。

第二，指南指出，定性HIV RNA试剂结果“阳性”即可诊断HIV感染，而如前所述，定性试剂一般而言比定量试剂更灵敏，如果顾虑污染，定性试剂的污染可能性更大，但指南却对定性试剂的结果不做限定（定性“阳性”即可诊断），可见，定量检测试剂>5000cp/ml这一诊断阈值的设定，容易造成诊断的双重标准，形成逻辑困局。

我们在临床实践中也会遇到HBV、HCV核酸检测污染的问题，但都可以通过各种办法发现并减少污染的发生。遵循SOP能有效减少污染的发生。同为RNA病毒，没有任何肝病指南要求HCV>5000cp/ml才可确诊丙肝，而是均推荐使用灵敏的试剂进行诊断和治疗监测。同样，HIV检测也不能因惧怕污染导致结果不准而踌躇不前。另一方面，设定HIV RNA 5000 cp/ml作为“防线”，也未必能堵住污染的可发生，高值“假阳性”的情形，其实也能遇到。

低病毒载量的样本，也不能认为阳性预测价值就低，还可能是由检验试剂的局限造成。众所周知，相比HBV和HCV等病毒，HIV核酸序列的变异更大，因此，需要设计能覆盖所有基因型和突变的引物和探针。5‘-长末端重复序列（LTR）、组特异蛋白（gag）和聚合酶（pol）区是引物和探针最常针对的位置（见下图）。

图源于：https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/MAP/landmark.html，有修改

2013年，德国红十字血液中心研究显示，针对单一位置（如LTR）设计引物/探针的RNA试剂，可能低估病毒载量，甚至漏检^[8]。因此，为了减少低估甚至漏检HIV的风险，德国保罗-埃利赫研究院（Paul-Ehrlich-Institute，PEI）要求HIV RNA试剂应识别2个或以上的基因组区位。罗氏Cobas Taqman试剂，针对的位点是LTR和gag；盖立复Procleix Ultrio试剂则是针对LTR和pol，但并非所有试剂品牌都遵循该建议，对于使用单一位点引物和探针的试剂而言，即使低值RNA结果，也不能认为HIV复制式微。

没有任何一种检验方法和指标能100%确诊某种疾病。无论一种实验室检测手段多么准确，面对一个没有任何可疑病史和临床表现的被测试者，阳性结果的预测价值都是有限的^[9]。一定要紧密结合临床，仔细询问病史，才能做出正确的诊断。

综上所述，鉴于HIV感染属于典型性病，且尚无根治办法，在我国HIV检验报告流程又有一定的特殊性，谨慎报告阳性结果无可厚非。但HIV RNA>5000cp/ml这一诊断阈值设置过高，建议适当降低该阈值。对于低病毒载量样本，若复测仍为“阳性”，同时结合被检测者的病史，也可诊断HIV感染。感染极早期、HIV RNA低值阳性者若及早治疗，受益更大。此外，从技术层面上说，HIV RNA试剂的设计和生产，与HCV RNA试剂并无二致，因此，HIV RNA试剂的价格不应高高在上，而应符合我国经济发展水平，这也有助于NAT推广至有资质的临床PCR实验室，逐渐替代WB试验。

【参考文献】

[1] Morb Mortal Wkly Rep. 2013,62:362-5

[2] Laboratory testing for the diagnosis of HIV infection: updated recommendations. 2014. https://stacks.cdc.gov/view/cdc/23447

[3] J Clin Virol. 2017,91:73-8.

[4] 国际流行病学传染病学杂志. 2018,45:361-77.

[5] 传染病信息. 2019,32:16-20.

[6] 公众微信号“中国疾控艾防中心”：新的艾滋病诊断标准将全面纳入核酸检测

[7] Int J STD AIDS. 2014 Sep;25(10):695-704. 

[8] Transfusion. 2013, 53:2422-30.

[9] Evidence-based medicine. New York: Churchill Livingstone; 1997:227-34.