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争鸣!HIV感染诊断标准 RNA>5000cp/ml的尴尬

面气灵 2019-9-2 119人围观 医学


作者:北京大学人民医院副研究员 杨瑞锋

项目资助:北京市卫生与健康科技成果与适宜技术推广项目(2018-TG-19)



人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染是当前一个严重的医学和社会学问题。但HIV感染症状不典型,确诊依赖于实验室检测,包括HIV抗体和/或p24抗原检测,以及核酸检测(nucleic acid test, NAT)即HIV RNA检测(HIV DNA较少开展)。


我国当前仍倚重HCV抗体检测,HIV的诊断策略也不同于美国等国家—我国各级医院或其他检测机构HIV“初筛”阳性后,需要将样本送至各级CDC,进行免疫印迹(WB)试验作为补充试验(一般习惯称作“确认试验”),初筛机构并不具备出示HIV感染“阳性”报告单的资质。


随着化学发光为代表的新一代灵敏的免疫检验技术及以实时荧光PCR为代表的核酸检测技术(NAT)的发展和成熟,WB相比之下变成了检验舞台上一种“古老”的技术。


我们可以联想,在2013年左右,作为经典的HCV抗体确认试剂—Chiron公司的重组免疫印记试剂(RIBA) HCV3.0版不再生产,告别了丙肝诊断的舞台,美国FDA批准的唯一用于验证HCV抗体阳性结果的指标,变成了HCV RNA[1]


很快,2014年美国CDC更新了HIV结果报告导则[2],流程图里,也使用HIV-1/2抗体鉴别试验(快速试剂)取代了传统WB的位置。两种策略均突出了NAT的重要性,尤其对于急性感染或免疫缺损人群而言,NAT尤为必要,与此同时,抗体确认试验的重要性大大降低。




每天的临床实践经验也告诉我们,WB作为最终的确认试剂有较大局限性。


第一,它并不特异。很多第三代或四代的HIV免疫试剂“低值阳性”结果为“假阳性”结果,例如文献报道,对于HIV感染的低危人群而言,雅培Architect HIV combo试剂(第四代试剂)检验结果低值阳性(S/Co值1.00-15.00之间)均为“假阳性”[3],但我们发现不少这样初筛结果的样本送至CDC,回馈“不确定”结果,容易给患者带来不必要的的精神负担,也会影响其进一步的诊治


第二,它并不敏感。WB检测抗体的灵敏度本身就不及化学发光技术,此外,第四代、第五代化学发光试剂可以同时检测p24抗原、病毒特异性IgG、IgM抗体(表1),而WB一般只能检测IgG抗体,势必会延长检测“窗口期”,漏诊急性感染患者。我们见过化学发光S/Co>500而CDC反馈WB结果“不确定”的病例。


第三,WB的操作复杂耗时,判断结果较为主观,即使经验丰富的技术人员发送结果也难免“压力山大”。


表一:HIV血清学检验试剂的发展史


2018年,我国更新了艾滋病诊治指南,逐渐与国外颁布的指南中的理念接轨,其中突出的一点就是提升了HIV RNA检测的地位,强调HIV核酸定性或定量检测也可作为诊断依据,尤其是对于抗体确认试验结果为“不确定”的患者;也肯定了HIV RNA在早期明确HIV感染方面的重要性,鼓励医院开展HIV核酸检测和结果咨询[4,5]


但值得关注的是,该指南中,诊断HIV感染标准之一是,“核酸定性检测阳性或核酸定量大于5000拷贝(cp)/ml”,但并未附相关的参考文献或经验性数据支持5000cp/ml这一阈值的设定。


2019年,由中国CDC牵头修订的《艾滋病和HIV感染诊断》行业标准(WS-293-2019)则继续沿用了该阈值。其设定或是基于检测试点累积的数据(可能也属于“内部数据”)[6],或是出于降低NAT“假阳性”结果的考量,但即使如此,5000cp/ml这一阈值仍有待商榷,其循证医学证据可能稍显不足。笔者认为,当前HIV感染,包括急性感染和传播的形势严重,同时,HIV RNA检验试剂的性能较为可靠,应降低诊断HIV感染的RNA阈值,理由如下:


1、设定HIV RNA诊断阈值,容易造成用一种“不确定”结果代替另一种“不确定”结果的尴尬局面


引入HIV RNA的目的之一,就是要避免像WB那样容易产生“不确定”结果而延迟诊断和治疗。但5000cp/ml阈值的设定,同样会人为造成结果“不确定”,影响结果判断,也影响患者诊断和治疗的依从性,因此,可能并非一种高效的卫生经济学策略。再者,低病毒载量结果是一种客观存在。例如,暴露的极早期,HIV刚开始复制,会有短暂的血清低病毒载量期;再如,少数采取HIV暴露前或暴露后预防失败的被测者,血清HIV RNA也会出现极低值,等等。从检验方法角度上看,还可能出现因为检验试剂性能缺陷(如HIV突变引起引物或探针不完全匹配、RNA提纯不完全混入抑制物、PCR体系效率低下等等)而导致的低病毒载量的假象(下面会有详述)——但这些RNA“低值阳性”情形,几乎都可确诊HIV感染。

2、当今商品化HIV RNA试剂的灵敏度已经足以胜任低载量病毒的检测


HIV RNA检测已有成熟的国际标准品作为溯源,基于实时荧光技术的检验试剂也很成熟。下图列举了具有代表性的国内外HIV检测试剂品牌的灵敏度,不管是定性还是定量试剂,其最低检测限(LOD)均远小于5000cp/ml。以赛沛Xpert HIV RNA等为代表的即刻检测(POCT)核酸定量检测试剂,灵敏度也不逊色。与此同时,在血站,具有极高灵敏度的HBV DNA/HCV RNA/HIV RNA三联检测已经广泛开展多年,有效地保障了血液安全;而若在临床设定5000cp/ml的诊断阈值,可能是对现有诊断试剂性能的浪费。传染病诊治指南的制定可建议邀请更多检验技术和体外诊断(IVD)技术专家参与,可能会对关键技术和试剂的临床应用细则形成更好的把控。



3、 美国CDC指南并未对HIV RNA设定诊断阈值


如前所述,美国的指南中,并未限定HIV RNA的诊断阈值,建议“阳性”即可诊断HIV感染[2]。欧洲2014年HIV检验指南中[7],倒是建议<1000cp/ml的低载量结果需要结合其他指标综合分析,这可能是出于对RNA检测污染的顾虑,但其引用的3篇报道污染的文献均为2006年及之前,出现污染的试剂为基于信号扩增原理的分支DNA(bDNA)试剂,或基于PCR产物杂交原理的Amplicor试剂,使用这些试剂检测,需开放操作,气溶胶污染的风险大,并且报道的污染案例,假阳性RNA载量都在这些试剂的LOD附近。


而现今这些试剂大都被基于实时荧光PCR技术的试剂所取代,全程实时检测扩增信号,不需要对PCR产物开盖检测,虽然灵敏度得到了很大的提高,LOD一般都在50cp/ml或以下,但气溶胶污染风险却降低。


4、 设置HIV RNA诊断阈值为5000拷贝/ml,与HIV感染“发现即治疗”的指导思想并不一致


艾滋病发现越早、治疗越早,越有利于延长生命,其传染性也越受限。这是防控艾滋病的关键。按照2014年艾滋病治疗标准,能享受免费治疗的HIV感染者和艾滋病患者,需CD4细胞数<500个/mm3;而更新的指南不再设置CD4细胞数的“门槛”,发现即治疗,即,确诊即治疗,该理念也开始与国际接轨。新的治疗标准和治疗理念,应以大力宣传,尤其应在高危人群广泛传播。


但设定>5000cp/ml再启动治疗的新“门槛”,谈不上是积极的举措。联想HBV和HCV感染的诊断,欧美和中国的指南均强调使用高灵敏、低检测下限的诊断试剂,核酸“阳性”即启动治疗,该策略对HIV感染者尤为必要,因为及早治疗甚至可能阻断病毒整合入人的基因组,避免形成稳定的病毒库,感染者极大受益。当前HIV RNA检测的周期普遍偏长,特别对于那些样本量少的实验室,出报告可能需要3-5个工作日甚至更久,这也就意味着,对那些RNA阳性但又<5000cp/ml的感染者,若像指南推荐那样需要重新采血复测,他诊断和治疗的时间便被拖延1周甚至更久,以致于感染者可能会因为不愿或不便复测而脱落。

检验医学网

5、 设定阈值造成指南中两处HIV诊断标准的自相矛盾


第一,新指南定义治疗HIV“病毒学失败”的定义是,治疗48周后,HIV RNA>200cp/ml。如果顾虑<5000cp/ml的检测值不准确,那么,200cp/ml的检测准确性也无从谈起。


第二,指南指出,定性HIV RNA试剂结果“阳性”即可诊断HIV感染,而如前所述,定性试剂一般而言比定量试剂更灵敏,如果顾虑污染,定性试剂的污染可能性更大,但指南却对定性试剂的结果不做限定(定性“阳性”即可诊断),可见,定量检测试剂>5000cp/ml这一诊断阈值的设定,容易造成诊断的双重标准,形成逻辑困局。


6、污染是微生物核酸检验的共性难题,但HIV RNA检测不应被特殊对待


我们在临床实践中也会遇到HBV、HCV核酸检测污染的问题,但都可以通过各种办法发现并减少污染的发生。遵循SOP能有效减少污染的发生。同为RNA病毒,没有任何肝病指南要求HCV>5000cp/ml才可确诊丙肝,而是均推荐使用灵敏的试剂进行诊断和治疗监测。同样,HIV检测也不能因惧怕污染导致结果不准而踌躇不前。另一方面,设定HIV RNA 5000 cp/ml作为“防线”,也未必能堵住污染的可发生,高值“假阳性”的情形,其实也能遇到。


7、不能忽视因试剂性能缺陷造成HIV RNA检测结果被“低估”的问题


低病毒载量的样本,也不能认为阳性预测价值就低,还可能是由检验试剂的局限造成。众所周知,相比HBV和HCV等病毒,HIV核酸序列的变异更大,因此,需要设计能覆盖所有基因型和突变的引物和探针。5‘-长末端重复序列(LTR)、组特异蛋白(gag)和聚合酶(pol)区是引物和探针最常针对的位置(见下图)。


图源于:https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/MAP/landmark.html,有修改


2013年,德国红十字血液中心研究显示,针对单一位置(如LTR)设计引物/探针的RNA试剂,可能低估病毒载量,甚至漏检[8]。因此,为了减少低估甚至漏检HIV的风险,德国保罗-埃利赫研究院(Paul-Ehrlich-Institute,PEI)要求HIV RNA试剂应识别2个或以上的基因组区位。罗氏Cobas Taqman试剂,针对的位点是LTR和gag;盖立复Procleix Ultrio试剂则是针对LTR和pol,但并非所有试剂品牌都遵循该建议,对于使用单一位点引物和探针的试剂而言,即使低值RNA结果,也不能认为HIV复制式微。


8、紧密结合临床,才能做出最终的正确诊断


没有任何一种检验方法和指标能100%确诊某种疾病。无论一种实验室检测手段多么准确,面对一个没有任何可疑病史和临床表现的被测试者,阳性结果的预测价值都是有限的[9]。一定要紧密结合临床,仔细询问病史,才能做出正确的诊断。


综上所述,鉴于HIV感染属于典型性病,且尚无根治办法,在我国HIV检验报告流程又有一定的特殊性,谨慎报告阳性结果无可厚非。但HIV RNA>5000cp/ml这一诊断阈值设置过高,建议适当降低该阈值。对于低病毒载量样本,若复测仍为“阳性”,同时结合被检测者的病史,也可诊断HIV感染。感染极早期、HIV RNA低值阳性者若及早治疗,受益更大。此外,从技术层面上说,HIV RNA试剂的设计和生产,与HCV RNA试剂并无二致,因此,HIV RNA试剂的价格不应高高在上,而应符合我国经济发展水平,这也有助于NAT推广至有资质的临床PCR实验室,逐渐替代WB试验。


【参考文献】

[1] Morb Mortal Wkly Rep. 2013,62:362-5

[2] Laboratory testing for the diagnosis of HIV infection: updated recommendations. 2014. https://stacks.cdc.gov/view/cdc/23447

[3] J Clin Virol. 2017,91:73-8.

[4] 国际流行病学传染病学杂志. 2018,45:361-77.

[5] 传染病信息. 2019,32:16-20.

[6] 公众微信号“中国疾控艾防中心”:新的艾滋病诊断标准将全面纳入核酸检测

[7] Int J STD AIDS. 2014 Sep;25(10):695-704. 

[8] Transfusion. 2013, 53:2422-30.

[9] Evidence-based medicine. New York: Churchill Livingstone; 1997:227-34.

来自: 检验医学网
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