NGS丨测序相关名词解释汇总-基础概念篇

测序，又称基因测序，主要是指通过基因测序设备对脱氧核苷酸（DNA）进行其碱基排列顺序测定的技术。

具体而言，主要是测定包括腺嘌呤（A），胸腺嘧啶（T），胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）四种碱基的排列顺序，从而解读所蕴藏的DNA遗传密码。虽然现也可对RNA进行测序，不过目前主流的RNA测序方法是先将RNA转换为cDNA，继而进行测序，故仍可归之于DNA测序。

Q2：什么是二代测序？

二代测序技术，能够一次并行对几十万到几百万条DNA片段进行序列测定，也称为高通量测序技术（High-throughput sequencing）或大规模平行测序（Massively parallel sequencing，MPS）。不同于之前的Sanger测序，它的速度更快，价格也更为便宜，是对传统测序的一次革命性改变，也由于其跨时代的意义，这类测序技术被称为第二代测序或下一代测序（next generation sequencing ，NGS）。由于NGS可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。

原理：以lllumina平台的工作原理为例：从本质上而言，二代测序（NGS）和Sanger测序相同，都是在每一个测序周期中，利用计算机检测DNA聚合酶催化荧光标记的dNTP结合到DNA模板时产生的荧光信号。但与Sanger单位时间检测单片段不同的是，NGS能同时检测成千上万的孔道的信号，因此大大提高了效率。

工作流程：

llumina工作过程可以分为以下四步：

1.文库准备：提取的DNA和cDNA通过物理或其他方法随机切割成相同大小的片段，并在5'和3'添加接头(adapter)。该接头主要用于提高PCR效率，在测序时提供barcode/index。

2.生成簇：通过桥式PCR，单片段序列被大量扩增成簇。

3.测序：每个片段基于SBS（边合成边测序）原理，由计算机读取read。

4.数据比对和分析。

单端测序（Single-read）是指首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列。该方式建库简单，操作步骤少，可快速、经济地提供大量的高质量数据，对于小RNA-Seq或染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）等，是很好的选择。

双端测序（Paired-end）是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块（Paired-End Module）引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序。

双端测序较单端测序的优势主要有以下两点：

1、Illumina测序的片段长度较短，单端测序对于不同位置重复出现的序列片段识别出相同的信息，这导致将该序列比对至参考序列中时，出现一定的误差。而双端测序中，不同读段间的距离已知，即使对于重复出现的序列，双端测序也可推断出不同序列出现的位置，大大减少了序列比对的误差，故双端测序的序列信息往往可以得到较好的组装结果。

2、所有的reads只能按照一个方向进行读取时，会导致测序的质量随着读取长度的增加而下降。对于单端测序，其测序的质量会随着测序的进行而下降，所以reads越往后面越不准确，下游测序质量就会较差；而双端测序会从两个方向读取超过待测序列的一半，再根据两个序列重合部分进行拼接，读取序列的质量整体会优于单端测序的结果。

基础概念篇主要是这些，进阶篇将会继续介绍测序深度、测序覆盖度等概念