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文章内容整理自广东省人民医院检验科 顾兵 教授的专题讲座 感染性疾病是患者就医过程中最常见的疾病之一，究其原因，主要是病原体（细菌、真菌、病毒等）侵袭人体各个部位，治疗的首要任务就是找到病原体，并针对性用药。因此，快速、准确地发现病原体，对诊疗和愈后有着重要意义，真菌快速检验技术也随之受到重视。 以往，真菌检验技术多以较为传统的真菌培养以及真菌涂片镜检、血清学检查、分子生物学技术以及质谱技术等为主。而在近年来，随着POCT 技术的发展以及人们日益增长的需求，传统技术得到了更进一步的优化改进，分子生物学及质谱相关技术均得到了充分的普及应用。 真菌感染监测面临的难题 侵袭性真菌病感染具有感染性强、致死率高的特点，重点人群真菌病发生率逐年增高。根据 2012 至 2017 年 HIV 发病率水平预测，2050 年中国 HIV 相关侵袭性真菌病的负担值将变得非常严重，且中国的真菌病具有非常明显的地域差异。例如，马尔尼菲篮状菌病主要发生在中国南部珠江流域，与全球变暖引起的亚热带河流微真核生物群落的改变有关。组织胞浆菌病主要分布在长江地区，而且大多为本地病例，输入性病例少，华南地区的空气比较潮湿，非常适合真菌的生长。 以广东省为例，据 2021 广东省真菌监测数据显示，白念球菌仍然是最常见的治病菌，非白念球菌和丝状真菌的不断增加，同时曲霉也成为重要的致病真菌。因此，积极建立真菌联盟，动员各方力量做好真菌监测就变得尤为重要。 具体到检测层面，传统方法也多存在各种局限性。培养法，敏感性和特异性有限，部分真菌培养周期长或无法培养；镜检，无菌部位、体液阳性率低，无法区分定值与感染，且存在漏检、错检的情况；组织病理学 / 细胞学检查，属于有创检查，病人依从性差，有风险，阳性率低，且技术要求较高；影像学检查，特异性不强且对血液病合并侵袭性真菌病（IFD）的诊断时间较晚，对血流感染无诊断价值。 再看实验室硬件方面，国内的整体真菌诊断水平仍然较低，多数医院没有独立的真菌检测区域，缺少独立的真菌安全柜，从事真菌学研究的检测人员也极其有限，开展的真菌项目较少，质量管理及标准化操作意识不强。据广东省 99 家三级医院的一项调查数据显示，60% 以上的医院没有独立的真菌检测区域、独立真菌安全柜，大部分医院未开展丝状真菌药敏和菌种保留。在真菌项目方面，GM 实验、隐球菌抗原、念珠菌抗原抗体、荧光染色普及率仍较低，亟需进一步拓展。 检测方法及平台的优劣对比 真菌的实验室方法包括涂片、镜检、培养、血清学、分子生物学、NGS、质谱等。 在血清学检测方面，曾有人指出已进入“5G”时代，即 G 试验、GM 曲霉抗原、IgG 曲霉抗体与IgE曲霉抗原、IgG念珠菌抗体与Mn 念珠菌抗原、GXM 隐球菌抗原，具体到快速检测平台，则包括了泛真菌 G 试验-POCT诊断平台、西富病 POCT 诊断平台-Quic系列、隐球菌GXM 检测 -POCT诊断平台等，具有简单安全、准确便捷、快速响应、随到随检等优势。
荧光染色是通过荧光染料与真菌细胞壁中的几丁质成分特异性结合，使真菌细胞壁被荧光，荧光显微镜下观察到真菌的形态，临床中应用广泛。 看一个案例，一名 72 岁的男性患者以“全身瘙痒 12 年，红斑渗出半年”入院，前胸及颈肩部出现大片湿疹。临床微生物医生经过床旁采样后，组织革兰染色可见圆形孢子，是念珠菌孢子？隐球菌？还是粗球孢子菌？因孢子结构不清楚，所以难以辨认。随后加做六铵银染色，可见褐色孢子，但内容物依旧不清楚，无法辨认。再加做真菌荧光染色，则可见孢囊，怀疑无绿藻的可能性大，随后立刻联系临床医生，采用伊曲康抗感染，患者病情好转，而在随后细菌培养中也证实是小型无绿藻。
从左至右，依次为组织革兰染色、六铵银染色、荧光染色 质谱技术的应用，让检验人员有机会鉴定了更多的不同菌种。以广东省人民医院检验科为例，利用 MALDI-TOF MS（飞行时间质谱）技术鉴定的酵母菌已达 32 种，丝状真菌达 45 种。但是，也依然存在部分质谱技术无法鉴定的真菌，主要原因在于数据库的丰富程度。所以，数据库的拓展对于临床而言具有重要意义。 数字 PCR 与 ddPCR（微滴式数字 PCR）技术近年来也备受推崇。ddPCR 的灵敏度较高、靶向性较好。2022 年 2 月 19 号，在《中华检验医学杂志》上发布的《血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识》中，多重 PCR 与 ddPCR 被正式写入，建议微生物学实验室根据自身条件决策和建立快速鉴定方法和直接药敏试验；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱、单靶标聚合酶链反应、多重 PCR、微滴式数字 PCR 技术等可在 3 小时内完成培养液直接鉴定。 快速检测技术作用凸显 目前，SERS（表面增强拉受散射）技术因其快速、无损、高灵敏、指纹谱检测等优点，已广泛应用于核酸、蛋白质、细菌、真菌、细胞、重金属、食品安全等领域。广东省人民医院检验科还将SERS 技术应用在真菌检测中，首次通过 SERS 指纹图谱鉴定临床白念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌，利用 SERS 还可将 4 种毛霉目真菌准确鉴定到种水平。该方法可以同时、快速、准确地鉴定复杂临床样本及环境样本中的 4 种重要病原菌，灵敏度达 10 cells/mL（比传统胶体金试纸条提高 500 倍），总体检测时间小于 20 分钟。 除此之外，还有基于核酸扩增的真菌血流感染诊断技术， 原理是扩增全血样本中的念珠菌 DNA，利用磁共振技术 +PCR 技术检测扩增的 DNA，可快速将念珠菌鉴定到种，具有较高敏感度和特异度。但目前检测念珠菌种类仍然较少，不能检测耐药基因，且由于价值有限且费用昂贵，未在临床广泛应用。未来，随着 LDT 政策的推广与实施，也希望能让更多的患者享受到新技术带来的便利。 具体到检测平台应用方面，兼具小型化与便捷化的 POCT 产品必然是未来趋势之一。分子POCT 平台也正朝着多维度方向发展，例如，曲霉多重 PCR 检测试剂盒，可对土曲霉、黄曲霉、黑曲霉进行快速鉴定，无需培养，全程仅需 2.5 小时；念珠菌多重 PCR 试剂盒，可对克柔、光滑、热带、白色和近平滑进行鉴定，无需培养，全程仅需 2 小时。此外，还有耳念珠菌核酸检测试剂盒、耶氏肺孢子菌及磺胺类耐药基因核酸检测试剂盒、马尔尼菲篮状菌核酸检测试剂盒、毛寡核酸检测试剂金等，可实现对罕见真菌的分子诊断。 综上所述，现阶段实验室的真菌诊断技术均存在利弊，快速便捷的非培养技术虽然在真菌检测领域发挥了重要作用，但仍要注意与传统方法相配合，检验人员应精心选择和开发合适的关键技术的组合方式，以更快速、更便捷的方式为临床和患者服务。 |
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