|
作者：印晓静 胡嘉波 韩崇旭 王云霞 府伟灵 张阳
CRISPR/cas9从发现至今已经超过30年，1987年，日本学者石野良纯在大肠埃希菌iap基因3′末端的侧翼区发现了一种不寻常的间隔重复序列[1]，随后这种间隔重复序列被发现广泛存在于大多数的细菌和古菌基因组中。2002年，此序列被正式命名为"成簇的规律间隔的短回文重复序列"（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）[2,3]。随后的研究陆续发现并证明了细菌可能利用CRISPR/Cas系统抵抗噬菌体入侵[4]，阻止外源质粒转移[5]。2012年，具有RNA指导的靶序列识别和蛋白质介导的DNA切割核酸内切酶作用被进一步证明[6,7]。2014年，单引导RNA（singleguide RNA，sgRNA）、Cas9和DNA复合体的晶体结构被解析[8]。很快CRISPR/Cas9基因编辑被广泛应用在工业和医学科研领域，如奶制品的发酵，多个物种基因组的定点修饰，包括基因定点InDel突变等。近年来，CRISPR/Cas9技术在遗传性疾病及其他疾病治疗中，基于体外细胞水平及动物模型水平不断有大量进展和突破性研究，如用于校正基因突变，证实其在有效治疗遗传性疾病中的潜力[9,10]；被用于开发靶向疗法针对特定肿瘤治疗[11]及其他疾病类型[12,13]；靶向及追踪活细胞中疾病相关RNA的活动过程，操控基因转录进行疾病建模[14]；全新的"碱基编辑器"的开发[15]以及CRISPR结构和机制的深入探索[16]等。作为第三代基因编辑技术，CRISPR/Cas9比第一代技术锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）和第二代技术转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）更加高效、准确、快捷、廉价。CRISPR/Cas系统主要分为TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ 3种类型，根据系统中包含的cas基因种类的不同，TypeⅡ可再细分为TypeⅡA、TypeⅡB、TypeⅡC 3种亚型，通常Type Ⅱ型包括cas9、cas1、cas2基因和CRISPR序列。CRISPR/Cas9属于TypeⅡA型，是被改造得最为成功的人工核酸内切酶，目前广泛应用于真核细胞的基因组编辑中。CRISPR/Cas9基本结构从5′到3′端依次是反式激活RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）序列区、Cas9基因序列区和CRISPR序列区[17]。CRISPR/Cas9系统抵抗外源物质的入侵通常分为3个阶段，分别是适应、表达和干扰阶段[18]，继而降解外源DNA，使其无法进行转录和翻译，以此维持细菌的稳定。在实际应用中，需要设计sgRNA实现对Cas9核酸酶的引导，在前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）位置才会有高效率的特异性识别和切割。通常将crRNA和tracrRNA设计融合成一条sgRNA实现对Cas9核酸酶的引导[6,7]。设计者通过添加GAAA接头有效地将crRNA的3′末端融合到tracrRNA的5′末端，并形成稳定的茎环结构，从而模拟出DNA切割所需要的双重RNA环境。sgRNA的作用与tracrRNA和crRNA的作用一样，Cas9在其引导下可以实现基因的定向编辑。sgRNA的设计为CRISPR/Cas9的广泛应用和基因编辑的迅速发展创造了基础。Cas9蛋白在外源DNA上作用的位点称为PAM[19]，一般来说，只有在PAM位置才会有高效率的特异性识别和切割。其长度一般为2~5碱基，是一种保守的短核苷酸基序。在CRISPR/Cas9中，通常要求PAM为NGG，即第一个碱基的类型可以任意变换，但后两个须是鸟嘌呤；在人类基因组中，平均每8 bp就会出现一个NGG，因此CRISPR/Cas9被认为可以对人类基因的任何片段进行编辑。Cas9核酸酶中存在一种晶体结构[20]，这种结构由识别瓣叶（recognition lobe，REC）和核酸酶瓣叶（nuclease lobe，NUC）组成。REC识别并结合sgRNA和目标DNA；NUC负责切割靶标DNA，它包含3个功能域，其中两个负责剪切crRNA互补链和非互补链，第三个功能域则是PAM的相互作用区。三、CRISPR/Cas9在核酸分子检测技术中的应用进展CRISPR/Cas9为研究基因功能、调节元件以及疾病病理机制提供了分子基础；随着CRISPR结构和机制的深入探索，CRISPR技术的特定靶向性、操作简便、快速高效、成本低廉等优势也给分子诊断技术的发展提供了新的角度。虽然目前CRISPR/Cas9在分子检测技术方面的应用刚刚起步，但已有如下研究将其和多种等温扩增技术及其他基因检测技术相结合，使得核酸分子检测更方便、快捷、高效，这对临床分子诊断的技术发展有着重要意义。寨卡病毒基因组的检测面临着快速、特异、操作简单的关键技术要求。2016年美国学者在Cell发表的研究[21]，提出了通过将等温RNA扩增和冻干纸基生物分子平台连接，构建纸基分子传感器，进一步将CRISPR/Cas9模块引入一起作为稳定的诊断系统；提取的病毒RNA通过核酸序列依赖性扩增技术（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA），并和冻干纸基传感器水合，RNA检测阳性便可通过纸盘的颜色由黄色变为紫色而体现。文章具体展示了一个基于CRISPR/Cas9技术的简单现场准备和样本处理流程及从病毒性猕猴的血浆中检测寨卡病毒的新技术，灵敏度达到fM水平。此应用将CRISPR/Cas9结合等温扩增技术发展成解决全球流行病的诊断工具，并且成本低廉，对解决重大公共卫生问题具有重要意义。对高特异性核酸进行快速而敏感的检测对于生物学研究和临床诊断具有重要的意义。我国学者用CRISPR/Cas9与等温指数扩增技术联合（CRISPR/Cas9 triggeredisothermal exponential amplification reaction，CAS-EXPAR）[22]，用于李斯特菌hly基因上一段含有"NCC"序列的DNA片段检测，该技术结合了CRISPR定点切割和EXPAR快速扩增动力学的优势。CRISPR/Cas9切割下来的DNA片段X，在指数扩增反应模板和DNA聚合酶的作用下进行互补扩增，此实验证明可以检测低至0.82 amol的DNA片段，灵敏度显著超越其他等温扩增技术。CAS-EXPAR无需外源引物，引物在切割过程中产生，避免了靶标非依赖性扩增，提高了特异性。此实验结合荧光定量分析，检测可在1 h内完成。将CRISPR/Cas9与等温指数扩增技术联合的CAS-EXPAR技术在核酸检测和分子诊断方面未来将有巨大的应用潜力和临床研究价值。将CRISPR技术和PCR结合，可以发挥CRISPR的高度特异性和PCR的高度敏感性。有实验证明[23]，将CRISPR/Cas9和反向PCR联合（Cas9/sgRNAs-associatedreverse PCR，CARP），可以在9种不同的HPV亚型中检测HPV16和HPV18的L1基因。在CARP中，目标DNA首先被cas9/sgRNA切割，切割下来的DNA会由T4 DNA连接酶连接，再通过PCR扩增。未被切割或未被连接的则不可以扩增。此方法具有高度特异性和敏感性，结合传统PCR检测可低至0.02 ng，结合定量PCR检测可低至0.002 ng。整个反应在3 h内完成检测，可以实现核酸分子快速检测和分子分型，且不牺牲高敏感性和高特异性，为今后临床分子诊断技术的发展提供了新思路。4．CRISPR技术与DNA突变检测技术联合应用：随着非侵入性诊断和个体化医学的发展，低频突变检测日趋重要，但在一些临床样本如血浆中，低频突变的检测常常受到野生型DNA高背景的限制而很难被确定。有文献报道了一种基于CRISPR/Cas9的DNA突变检测系统，即使在低频条件下也可以有效检测基因突变。该技术进一步用于表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和成人血红蛋白β亚基（hemoglobin-beta，HBB）体细胞突变的低频突变的DNA检测[24]。使用Cas9切割野生型DNA分子并富集突变型DNA，继而采用扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism analysis，AFLPA）和Sanger测序评估了基于CRISPR/Cas9切割的PCR的灵敏度，其中可以富集和检测1%~10%的突变，当与阻滞PCR结合时，其灵敏度达到0.1%。作者认为基于CRISPR/Cas9的DNA突变富集和检测方法未来将发展成为较为灵敏和方便的临床分子诊断方法。最新的研究将CRISPR/Cas9、滚环扩增（rolling circleamplification，RCA）和辣根过氧化物酶分离技术（split-horseradish peroxidase，split-HRP）结合，构建RCA-CRISPR-split-HRP（RCH）技术，运用到小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）的检测，进一步拓宽了CRISPR技术的应用范围[25]。相比较单纯的滚环扩增，因为结合了CRISPR和split-HRP，因此有更宽的检测范围和更高的灵敏度。该法通过底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB）颜色的变化，可显著鉴别非小细胞肺癌患者和健康人群，敏感度达到fM水平，特异性达到单个碱基。该方法可用于多种疾病的筛查、诊断和预测。当然，它在诸如蛋白浓度、最佳RCA反应时间和Cas9结合时间等方面，针对不同的靶标miRNA依然需要进一步的探索和优化。基于dCas9/sgRNA-SG Ⅰ（SYBR/Green Ⅰ）的CRISPR介导的DNA-荧光原位杂交技术（DNA-fluorescence in situ hybridization，DNA-FISH）系统，经实验证明可以简单快速、高灵敏度地鉴别含有mecA基因的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）基因组和mecA阴性的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-susceptible Staphylococcus aureus，MSSA）基因组[26]，检测限为10 cfu/ml，时间在30 min内。由于可以通过改变sgRNA序列改变dCas9/sgRNA的靶标，所以该检测系统不仅限于MRSA，还广泛适用于许多其他基因。该方法使用dCas9/sgRNA复合物作为靶向材料，SG Ⅰ作为荧光探针，以序列特异性方式与靶基因相互作用，使用细胞裂解物而不用对基因进行分离。四、CRISPR/Cas9在病原微生物检测中的应用进展细菌的分子分型对其流行病学监测具有重要意义，有助于从基因水平了解细菌的致病原理和耐药机制。CRISPR位点作为细菌分子分型的依据，其关键结构在于利用CRISPR区域中的重复序列和间隔序列。在细菌进化过程中，CRISPR结构的重复序列在种内保守，间隔序列由于插入和剔除因而组成排列具有极高的多态性，因此CRISPR阵列在细菌分子分型中具有高分辨力，成为细菌分型的理想依据。以下列举了该技术在空肠弯曲菌、大肠埃希菌、沙门菌和结核分枝杆菌等中的应用。空肠弯曲菌是发达国家胃肠炎病例中最常见的细菌病原体，研究者在使用CRISPR位点、扩增片段长度多态性分析（amplified fragmentlength polymorphism，AFLP）和多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）3种方法对184株空肠弯曲菌分型时发现，CRISPR位点可以区分约2/3的可分型菌株[27]。O157和非O157的肠出血性大肠埃希菌（enterohemorrhagic E.coli，EHEC）对于人类肠道疾病的影响是全球关注的重大问题，通过高通量实时PCR对958个大肠埃希菌菌株的CRISPR位点进行研究表明[28]，大肠杆菌的CRISPR多态性与O：H血清型和EHEC毒力因子存在很强的相关性。CRISPR-PCR检测的特异性范围97.5%~100%，灵敏度范围95.7%~100%，高于任何基于O-抗原基因的实时PCR方案。沙门菌是世界范围内食源性腹泻疾病的最常见原因之一，研究者在对属于130种血清型的783株沙门菌进行研究时，发现CRISPR多态性与血清型和多位点序列分型两者密切相关[29]。在另外一个实验中，研究者将两个毒力基因（sseL和fimH）和两个CRISPR位点结合MLST，以作为沙门菌分型的标记[30]，实验证明这种方案比普通的MLST具有更优越的分辨能力。此外，运用PCR扩增CRISPR的间隔序列对病原菌进行检测和分型，现已成为结核分枝杆菌分型的标准方法之一[31]。与传统的DNA限制性片段长度多态性（IS6110-RFLP）技术相比，该技术避免了培养的缓慢和技术的复杂，检测时间短、分辨率高，结果易于分析，有利于不同实验室的比较和多个国家间数据库的建立。CRISPR位点间隔序列的变化，某种程度上体现了细菌遭遇外源DNA攻击的历史。因此研究CRISPR位点间隔序列的特点，可以了解细菌的进化历程以及不同细菌之间的亲缘关系。研究者利用CRISPR位点的分子技术对中国、前苏联和蒙古的26个天然鼠疫疫源地的125株鼠疫杆菌的3个CRISPR位点进行分析，发现其间隔区及阵列的分布具有强烈的区域性和针对性，由此构建了鼠疫杆菌的假设进化模型，提出其传播途径[32]。此实验进一步说明CRISPR为细菌的进化和分型提供了重要的信息，有助于追踪疾病暴发的来源。CRISPR/Cas9技术作为一个高效简便特异快速的靶向编辑工具，在医学检验领域有着广泛的临床应用前景，仍然需要不断研究探索。首先，可以将各种扩增技术和CRISPR/Cas9结合，发挥前者的快速扩增动力学优点和CRISPR的高度特异性，这在生物分析和疾病诊断中具有巨大潜力。其次是深入研究其他类型的CRISPR系统，例如type Ⅲ中的cas13a/C2c2。cas13a和等温扩增结合可以快速检测单个DNA或RNA分子，2017年Science发表的一种基于Cas13a和重组聚合酶扩增的分子检测平台SHERLOCK，可以检测寨卡病毒和登革热病毒、鉴别循环肿瘤DNA突变等，具有极高的灵敏度；此外SHERLOCK试剂可以冷冻干燥利于长期储存及运输，同时易于在纸上重构，便于各种实验室应用[33]。而2018年Science发表的另一篇基于Cas12a与等温扩增的方法DETECTR，则快速特异地检测出患者标本中的乳头瘤病毒，为CRISPR的分子诊断提供了又一个简单高效的平台[34]。这些最新的研究提示，CRISPR技术在医学检验领域有着广泛和丰富的应用前景。本文综述了CRISPR/Cas9在核酸分子检测技术、病原菌分型检测，细菌进化研究等方面的研究进展。目前，CRISPR/Cas9技术在检测领域虽然刚刚起步，但作为一种基因编辑工具，当与现有的核酸扩增技术、发光技术、快速检测技术等相结合时，便展现出高度检测灵敏度、特异性，降低反应时间等巨大的技术优势。随着CRISPR技术自身的进步和更多在分子诊断领域的探索性研究，相信CRISPR/Cas9技术可以在检验医学的核酸分子诊断、病原菌检测等方面带来突破性的技术进步。 |
