综述丨外泌体在乳腺癌早期诊断中的研究进展

摘要

乳腺癌的早期诊断是改善患者预后的关键，现有临床诊断方法存在创伤性较高或敏感性不足等局限。外泌体作为肿瘤细胞分泌的纳米级囊泡，因具有非侵入性获取、体液中丰度高且携带特异性生物分子等优势，已成为乳腺癌液体活检领域的新型生物标志物。文章系统综述外泌体在乳腺癌早期诊断中的研究进展，重点阐述其作为诊断标志物的生物学基础，详细归纳核酸类和膜蛋白类标志物的最新研究成果，并比较各类外泌体分离检测技术的优缺点和应用场景。尽管外泌体展现出巨大的临床应用潜力，但其临床转化仍面临分离标准化、异质性干扰和检测成本较高等挑战。未来，通过多组学整合分析与新型检测技术的开发，有望推动外泌体在乳腺癌早期精准诊断中实现突破。

关键词

外泌体携带肿瘤特异性分子，如微小RNA（microRNA，miRNA）和蛋白质，这些分子可直接反映肿瘤的生物学状态，是早期诊断的理想标志物。miRNA通过调节肿瘤微环境促进转移前生态位的形成并介导免疫逃逸，在乳腺癌中表现为促进侵袭和耐药。作为细胞外囊泡，外泌体表面蛋白，如人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和CD9具有异质性，并形成独特的肿瘤特征，可实现生物活性物质的靶向递送，在乳腺癌进展，如肿瘤负荷增加或亚型分化时，出现差异性表达。这些变化可通过体液样本（如血清）非侵入性地被检出，其在体液中长期稳定，这使得外泌体检测技术在早期筛查中能突破传统组织活检的局限，提供微创途径，如在HER2阳性乳腺癌中，外泌体表面标志物的水平可准确反映肿瘤侵袭性和转移风险。

2.1　核酸类标志物

外泌体中的核酸类分子，包括mRNA、miRNA、长链非编码RNA（long non-codingRNA，lncRNA）和其他非编码RNA，已成为乳腺癌诊断的重要工具。Li等对45例血浆样本（包括健康对照和未转移、转移性乳腺癌）进行了外泌体miRNA测序，发现miR-361-3p表达水平随肿瘤恶性进展逐步升高，且与更高的组织学分级、更大的肿瘤体积和更晚期的临床分期显著相关，提示其或可作为乳腺癌恶性进展监测和预后评估的生物标志物。还有研究发现，外泌体lncRNA与乳腺癌发生、发展有关，可通过液体活检鉴别乳腺癌患者和健康人对照者；部分研究已开发出高敏感的检测方法。另有研究发现，外泌体中的环状RNA（circular RNA，circRNA）是乳腺癌进展的关键调控分子，但具体机制尚不明确，目前仍处于机制探索阶段。

2.1.1　mRNA标志物

mRNA是外泌体核酸的重要成分，反映乳腺癌的肿瘤分子特征和生物学状态，可作为潜在的诊断标志物。目前，外泌体携带的mRNA作为乳腺癌诊断标志物的研究主要集中于肿瘤特异性基因表达谱方面。有研究结果显示，检测乳腺癌患者血浆外泌体中上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和黏蛋白（mucin1，MUC1）可有效区分乳腺癌患者和健康对照者，曲线下面积分别为0.98、0.99。还有研究发现，全转录组测序（RNA-sequencing，RNA-seq）可筛选出乳腺癌相关的差异表达mRNA，并与miRNA、lncRNA和circRNA共同构建调控网络。然而，外泌体mRNA在体液中的丰度较低，需结合高敏感的检测技术。如数字聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）来提升其临床应用价值。

2.1.2　miRNA标志物

miRNA在外泌体中表现最为突出，其凭借独特的分子构象和生物学特性，在肿瘤免疫调控中呈现双效作用，一方面通过介导免疫逃逸促进肿瘤进展，另一方面可激活抗肿瘤免疫应答抑制转移进程。有研究结果显示，三阴性乳腺癌中外泌体miRNA的失调与耐药和转移有关，如miR-92a通过促进上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）加速肿瘤进展，可作为治疗靶点。有研究筛选出血清或血浆外泌体中差异表达的miRNA组合（如miR-21、miR-155、miR-373），联合检测对乳腺癌早期诊断的敏感性和特异性分别为67%[95%可信区间（confidence interval，CI）为64%~71%]、81%（95%CI为77%~86%）。此外，乳腺癌患者血清外泌体中miR-21呈高表达，且与放疗后患者预后不良有关（高剂量放疗后外泌体中miR-21表达量增加2.82倍）。有研究基于TCGA数据库的分析结果，发现miR-21高表达患者放疗总生存期显著降低。外泌体miR-7641通过促进肿瘤进展和转移的细胞间通讯，可作为非侵入性诊断标志物，亦具有作为治疗靶点的潜力。

2.1.3　lncRNA标志物

外泌体lncRNA通过表观遗传调控发挥诊断价值。有研究结果显示，乳腺癌外泌体lncRNA H19可通过Wnt/β-catenin通路促进肿瘤干细胞特性，进而推动乳腺癌恶性进展，增强癌细胞放化疗抵抗性，并与患者预后不良有关。外泌体lncRNA HAGLROS在乳腺癌组织和血浆外泌体中呈高表达，在区分健康对照者和乳腺癌患者中表现出优异的诊断效能，且与患者预后不良显著相关，具有良好的临床应用潜力；功能上，乳腺癌细胞来源的外泌体lncRNA HAGLROS通过诱导肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）/M2型TAM极化，促进乳腺癌细胞增殖、迁移、EMT和血管生成。在分型和病情评估方面，外泌体lncRNA（如MIR193BHG）通过调控miRNA信号轴（如miR-489-3p/DNMT3A）参与骨转移微环境重塑，可反映肿瘤转移倾向。尽管上述发现具有重要意义，但该领域仍面临诸多挑战，多数外泌体lncRNA的作用机制尚未被完全阐明，如lncRNA HAGLROS调控TAM极化的具体通路；外泌体分离技术和lncRNA检测标准化仍需优化，且需进行大规模临床验证；不同乳腺癌亚型的外泌体lncRNA谱存在显著异质性，现有标志物的敏感性和特异性仍需进一步验证。此外，虽然靶向lncRNA（如敲除MIR193BHG）可抑制肿瘤转移，但靶向递送技术和体内稳定性仍是主要挑战。总体而言，外泌体lncRNA在乳腺癌诊断、分型和治疗监测中展现出广阔前景，但仍需进一步解决机制探索和技术标准化等关键问题。

2.1.4　circRNA标志物

外泌体circRNA因其闭环结构的高稳定性而备受临床关注。乳腺癌患者血清外泌体中circRHOT1呈高表达，可通过调控miR-204-5p/PRMT5轴来促进肿瘤进展。circRNA芯片检测结果证实，乳腺癌干细胞（breast cancer stem cell，BCSC）外泌体携带的circCARM1能够介导乳腺癌细胞发生代谢重编程；该circRNA可吸附miR-1252-5p，上调PFKFB2表达，最终调控乳腺癌细胞糖酵解过程。有研究结果显示，circ_0004771通过调控miR-653/ZEB2通路参与5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）耐药性。circ_0000190在三阴性乳腺癌细胞中显著下调，且作为miR-301a的分子海绵发挥作用，进而形成circRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）网络，影响肿瘤细胞增殖、迁移和凋亡等过程。

2.2　膜蛋白类标志物

外泌体的诊断价值不仅限于核酸成分，其膜表面蛋白特征同样具有重要的临床意义。外泌体膜表面呈现的跨膜蛋白异常表达谱与多种恶性肿瘤的相关性已获证实，但其高度异质性导致依靠单一标志物进行鉴别诊断存在显著局限。有研究结果显示，表皮生长因子样重复和盘状结构I样结构域蛋白3（endothelial growth factor-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3，EDIL3）在乳腺癌外泌体中呈特异性高表达，可作为三阴性乳腺癌的早期诊断标志物，目前已开发出基于磁性纳米球和荧光检测的快速诊断技术。HER2是乳腺癌关键的致癌基因，也是重要的亚型特异性标志物，可在外泌体膜表面表达。HER2阳性乳腺癌细胞释放的外泌体携带HER2蛋白，可通过高敏感性平台进行检测。如适配体功能化金纳米颗粒可实现CD63、EpCAM和HER2的同步检测。另外，MUC1是一种跨膜糖蛋白，在乳腺癌组织中常呈异常糖基化表达。有研究结果显示，在HR阳性/HER2阴性的浸润性乳腺癌中，MUC1的顶端定位模式与低复发风险和良好预后显著相关，提示其可能作为luminal A型乳腺癌的潜在指标。基于碳纳米管场效应晶体管的生物传感器已实现对外泌体MUC1的超灵敏检测，可有效区分乳腺癌患者和健康对照者。有研究结果显示，MUC1与其他膜蛋白标志物[如HER2、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）]联合检测可提高乳腺癌分子分型的准确性，特别是在luminal亚型鉴别中，特异性为86.2%。

分离纯化是外泌体检测的第一步，无论是从生物体液（血液、唾液等），还是从体外培养体系中获取外泌体，均需建立有效的纯化流程，以排除杂质等干扰物质。现行分离策略主要依据外泌体的粒径分布、浮力密度、表面电荷等理化特征和生物分子标记，分离方法主要有超速离心法、免疫亲和法、超滤法、尺寸排阻色谱、聚合物共沉淀法、微流体技术等，见表1。

乳腺癌外泌体的检测分析主要基于其物理特征参数和生物标志物表达谱。在物理特征方面，外泌体是30~150 nm的脂质双层细胞外囊泡，其粒径分布可通过纳米颗粒追踪分析等技术进行表征。在形态学特征方面，透射电镜观察显示外泌体呈典型的杯状或球形结构[56]。在密度特征方面，外泌体具有特定的浮力密度，这与其脂质组成和蛋白含量有关。在生物标志物表达谱方面，外泌体富含乳腺癌相关蛋白（如EpCAM、MUC1）和核酸分子（如miR-21），可反映肿瘤细胞的起源和状态。通过整合物理参数和分子表达谱分析，可提高乳腺癌诊断的准确性和特异性，并为个体化治疗提供依据。

外泌体携带特定的生物分子，在疾病早期筛查、预后评估和疗效监测中展现了巨大的应用潜力。这些囊泡在体液中循环，传递着反映细胞状态和疾病进程的关键信息。外泌体普遍存在于体液中，携带的特定分子内容能够反映来源细胞的状态，这使其成为一种非侵入性且具有高诊断价值的生物标志物。在恶性肿瘤的早期诊断中，外泌体因在生物流体中的高丰度和稳定性，被视为极具前景的生物标志物，不仅可用于恶性肿瘤的早期诊断，还能在治疗过程中监测疾病的发展和个体对治疗的反应，为临床提供实时的疾病管理信息。

然而，在诊断应用中，外泌体的临床转化面临多方面的挑战。首先，外泌体具有尺寸小、来源和分子组成存在异质性等特点，致使其缺乏标准化的分离和检测流程。这种技术障碍使得不同实验室之间的结果可比性受到限制。在肿瘤诊断中，外泌体亚群的异质性可能会掩盖关键生物标志物的特异性表达。其次，从经济成本角度看，外泌体检测依赖超灵敏分析技术，这些高端设备和技术人员的培养成本限制了在资源有限地区的推广。此外，在低收入地区开展外泌体生物标志物研究还需面对样本运输、冷链存储等基础设施不足的挑战，这使得外泌体检测在临床上难以普及。

外泌体凭借其独特的生物学特性，在乳腺癌早期诊断中显示出较高的应用价值。外泌体携带的特定核酸（如miRNA、lncRNA、circRNA）和膜蛋白（如HER2、MUC1）能够灵敏地反映乳腺癌的分子分型、肿瘤负荷和恶性进展，为无创或微创的液体活检提供了丰富的信息来源。另外，外泌体多组学整合分析将成为提升乳腺癌早期诊断精准度的关键。有研究结果显示，通过整合外泌体中的mRNA、miRNA和lncRNA等多组学特征，可建立更精准的液体活检诊断模型。结合蛋白质组学和放射组学数据的多组学分析，可显著提升对乳腺癌异质性的解析能力。在新型技术开发方面，开发高特异性捕获技术，如基于糖基印迹的电化学发光传感器，可精准识别乳腺癌外泌体表面多糖抗原，或发展便携式检测平台，如基于水凝胶的免洗脱手持离心装置，可简化外泌体分离流程。这些进展均标志着外泌体正从基础研究向临床转化迈进，新型分离和检测技术为外泌体研究提供了工具支持，但技术标准化不足和异质性等问题仍是阻碍其迈向临床的瓶颈。未来需通过标准化检测流程和大规模临床验证构建精准的诊疗体系。相关研究方向应聚焦于多组学整合，以挖掘更具代表性的标志物组合，并致力于开发高敏感性、低成本的新型检测平台。通过克服现有挑战，外泌体或可在不久的将来成为乳腺癌早期筛查和个体化诊疗体系中的重要一环。