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七大方法消除引物二聚体!

归去来兮 2022-5-26 153人围观 技术


我相信很多人听到引物二聚体都会生气,因为我们几乎每个人都被它折磨过。作为PCR的副产品,它有时是填充我们整个PCR实验过程的主要产物。当你被它折磨的时候,有没有想过为什么它总是出现在你的实验结果里?我觉得还是你不够了解,知己知彼百战不殆。当你足够了解它的时候,你就可以很容易地打败它,让它离开你。


接下来,就让我带你走进它的世界,认识它,了解它,最终打败它。


引物二聚体是什么鬼?


实际上,引物二聚体是引物本身3’端的碱基在Taq酶的作用下互补结合并从3’端延伸形成的一对引物或小分子量的双链DNA片段。



引物二聚体是如何形成的?


最根本的原因是引物之间或引物本身3’端碱基的互补组合


模板数量太低


引物浓度太高


引物长度太短


低退火温度


循环周期太多



如何区分引物二聚体和目标条带?


因为引物二聚体的大小从几十bp到几百bp不等,当你的目的条带分子量比较小时,电泳后的结果不一定是目的条带,很可能是引物二聚体,所以我们需要一种有效的方法来区分两者。在我们了解了引物二聚体形成的本质之后,就不难区分两者了。相信你看到这里已经知道引物二聚体形成的本质了,但是我想再强调一下,引物二聚体形成的本质其实是引物之间的部分互补结合,或者是引物本身的3’端区域。


也就是说,引物的形成不需要模板的参与,所以我们只需要在电泳时加入一组对照,就可以有效判断引物二聚体是否形成,如果形成,其分子量是多少,从而区分引物二聚体和目的产物。


这个比较就是:模板换成了H2O,其他都一样。在这种情况下,如果该泳道中有条带,则意味着形成了引物二聚体(当然,前提是系统没有被模板污染)。从这里也可以看出设置对比度的重要性。巧妙的对比往往能达到事半功倍的效果。


如何消除引物二聚体?


重新设计引物是解决这个问题最根本的办法:


增加模板的使用


降低引物浓度


引物长度适中


提高退火温度


减少循环次数


少量的甘油或DMSO可以适当地加入到混合物中。


最后,希望看完这篇文章,引物二聚体能永远离开你!


来自: Super Lab
我有话说......