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新冠病毒核酸检测中的内标及其作用

归去来兮 2022-5-18 2624人围观 技术

核酸检测作为新冠肺炎疑似病例的确诊依据,在疫情防控中发挥着至关重要的作用。“内标”基因作为体现核酸检测质量的重要指标之一,能够对采样、提取、扩增等多个环节进行监测,可作为室内质控的有力补充。

目前NMPA批准的所有新冠病毒核酸检测试剂均包含“内标”,可分为“外源性”和“内源性”两种。下面结合实验室常遇到的样本“内标扩增异常”情况,和大家探讨一下在质控满足要求时,如何正确的认识核酸检测中的内标基因。

内容概要

1. “外源性内标”和“内源性内标”的区别
2. 常见异常内标曲线及原因分析
3. 总结


01

“外源性内标”和“内源性内标”区别


02

常见异常内标曲线及原因分析

【1】外源性内标

⑴靶基因和内标均无扩增
可能原因无法明确是否存在检验前问题,多数为内标样本错加漏加、核酸加样时错加漏加;若连续多个样本存在此情况,首先考虑提取试剂、提取仪的问题。

⑵靶基因有扩增但内标无扩增
常见原因:应先明确靶基因是否同内标基因存在竞争或抑制作用,若不存在,原因同上,且该扩增孔可能存在污染。
下图为典型高浓度样本抑制内标基因扩增

⑶外源性内标基因扩增明显离散

常见原因外源性内标最大特点为均匀性好,故个别样本内标离散时多为反应体系中存在抑制物;部分连续样本内标离散时,应首先考虑提取试剂、提取仪的问题;若整板样本内标离散时,多为扩增体系配置时未充分混匀。
下图为本反应体系中存在抑制物

下图为因磁珠残留、加热模块异常,造成多个连续样本内标基因离散

⑷以上应对措施
更换试剂、耗材、仪器等条件进行复检;重新采样检测并严格按照SOP操作等。
【2】内源性内标
⑴需首先明确的是
内源性内标有典型扩增曲线并不代表采样成功,原因有:
①对于混采样本,只需1个受检者采样成功,内源性内标就会有扩增;
②如不能正确采样,仅采集口腔甚至皮肤样本,也会有内源性内标扩增;
③环境中可能存在人源性样本污染。
但需指出的是,采样不成功时,内源性内标一定无扩增
⑵靶基因和内标均无扩增
常见原因:实验室较为常见,涉及范围较广,包括检验前样本采集、保存、运送问题;检验中反应体系、提取、扩增问题以及人员操作问题等。
⑶靶基因有扩增但内标无扩增

常见原因:此情况极为少见,因内源性内标基因与靶基因通常无竞争或抑制作用,因此原因同上,且该扩增孔可能存在污染或非特异性扩增。

采样失败且靶基因非特异性扩增

⑷内源性内标基因扩增明显离散

常见原因由于采样质量直接影响内标扩增结果,故曲线较离散属于正常情况,并不一定是人员不规范操作所引起。

若排除检验前问题,整体内标曲线相对离散,可能由于样本未充分振荡混匀或扩增体系配置时未充分振荡混匀。

⑸以上应对措施
更换试剂、耗材、仪器等进行复检;重新采样检测并严格按照SOP操作等。
【3】其他常见的异常内标曲线
⑴曲线明显分为两簇
常见原因:
①提取仪异常导致提取效率低,多为加热模块故障、磁珠异常或磁珠残留;
②反应液放置时间过长导致扩增效率下降;

③不同采样管内的保存液对提取试剂的提取效率有影响。

⑵内标曲线不平滑(靶基因曲线正常)

常见原因:多为错用扩增程序,如A试剂反应体系使用了B试剂的扩增程序,可重新选择正确的荧光通道。


03

总结

不同形式的内标各有利弊,目前有证新冠病毒核酸检测试剂既有采用外源性内标的方式,也有采用外源性内标的方式。因此,实验室可根据具体使用需求和应用场景来科学看待并灵活选择。

核酸检测中的每一环节都有可能影响检测结果,如内标曲线出现异常时,应细心分析并明确其原因,以更为有效地保证新冠病毒核酸检测质量,为疫情防控保驾护航。

注:此篇文章为小黄同学原创,经其同意,本文对原内容稍作修改。
来自: 临床分子检测 | 作者:黄中强
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