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核酸提取前加入蛋白酶K预处理,提取效率会更高吗?

归去来兮 2022-5-13 49人围观 技术


作者:王晓燕

单位:同济大学附属东方医院胶州医院





新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎作为突发公共卫生事件,传播迅速广泛,已严重危害人类健康。因RT-PCR具有快速、简便、特异度好、灵敏度高、成本较低的优势,已成为SARS-CoV-2核酸检测的主要技术。然而,在实际的实验室检测中,患者的阳性检出率仅为30%~50%[1-3]





在临床实践中,利用蛋白酶K(PK)进行标本的预处理,提高核酸提取效率,从而提高阳性标本检出率是常用的方法。而关于PK预处理是否可以提高核酸提取效率,国内外所做研究报道较多,但结论并不一致。下面就核酸提取前是否需要加入PK预处理进行实验并探讨其应用。


实验设计


本实验选取60例鼻咽拭子标本,其中单采样本20例、10合1(10-in-1)混采样本20例、20合1(20-in-1)混采样本20例,进行PK预处理和未处理的磁珠法提取、RT-PCR扩增的内源性内参GAPDH基因循环阈值的统计分析。


实验结果



图1  单采样本未处理(左)和PK预处理(右)的RT-PCR内源性内参(GAPDH)扩增曲线

图2  10-in-1样本未处理(左)和PK预处理(右)的RT-PCR内源性内参(GAPDH)扩增曲线

图3  20-in-1样本未处理(左)和PK预处理(右)的RT-PCR内源性内参(GAPDH)扩增曲线


表1 各种样本PK预处理和未处理的RT-PCR内源性内参(GAPDH)的CT值统计资料


实验结论



图1、图2和图3显示,单采样本、10-in-1混采样本和20-in-1混采样本PK预处理和未处理,均能有效扩增GAPDH内参基因;表1显示,单采样本、10-in-1混采样本和20-in-1混采样本PK预处理和未处理的GAPDH内参基因循环阈值进行分析,差异无统计学意义(P>0.05)。


实验讨论及文献查阅



蛋白酶K(PK)可对生物标本中的蛋白质进行消化,同时还可降解标本中的RNA核酸酶,阻止RNA被降解,对标本进行PK预处理可能会提高核酸的提取效率,从而被广泛应用于RT-PCR中。

杜栩彬[4]等研究表明采用蛋白酶K处理粪便标本进行新冠核酸检测的敏感性优于未灭活处理和56℃水浴灭活处理;

KHELAIFIA等[5]对粪便标本中细菌DNA的提取中指出PK的预处理可提高DNA获得率;

还有研究表明在甲型流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒的痰液标本进行预处理的研究中,其结果均显示PK的预处理较未处理有更高的提取效率[6-7]

新冠核酸检测的专家共识[8]、工作手册[9]和防控方案[10]中,均指出痰液标本的处理时PK的临床应用。

但也有文献报道[11],在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统对SARS-CoV-2鼻咽拭子标本和粪便标本进行提取时,PK的预处理对核酸检测结果没有影响;

GOLDSCHMIDT等[12]则在对感染性病原体DNA提取的预处理一文中提出,在某些病原体的提取中,PK的预处理没有必要;

JEDDI等[13]研究寄生虫病和真菌病 DNA提取优化的分子诊断研究中,提出由于NucliSENS easyMAG磁珠提取系统中裂解缓冲液具有高解离活性,使PK在大多数情况下是可有可无的,以上结论均与本研究结论相符。


综上所述,造成这些结论不一的原因可能有如下几点:

(1)PK的比活性存在一定差异;

(2)寄生虫、细菌、病毒等不同病原体对PK的预处理效果存在差异;

(3)不同的标本类型及提取方法可能影响PK的预处理效果。因临床复杂样本(深部咳痰和气道抽取物)不易获得,而且本研究样本量和样本类型(鼻咽拭子)存在局限,所以PK预处理在RT-PCR中的应用应综合考虑。

但就磁珠法提取、RT-PCR扩增的单采、混采鼻咽拭子标本,可无需进行PK预处理,这在一定程度上节省了实验时间和实验耗材。

蛋白酶K知识拓展


蛋白酶K是蛋白酶的一种,属于碱性丝氨酸蛋白酶类,来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium al⁃bum Limber)。

首次由Hennrich于1973年报道,因其能降解角蛋白,故命名为蛋白酶K;1974年Ebeling等通过凝胶过滤大致确定其分子质量为(18 500±500)Da,等电点(pi)为8.9,最适pH在7.5~12.0,是一种碱性蛋白酶。

Jany在1985年报道了蛋白序列, Pahler在1984年报道了晶体结构,Gunkel在1989年报道了蛋白质大小。蛋白酶 K的基因有2个外显子和一个内含子;蛋白质结构由信号肽、前导肽和成熟肽组成。

蛋白酶K具有2个Ca2+结合位点,用乙二胺四乙酸螯合蛋白酶K中的Ca2+,处理3h其活性降低50%,而加入Ca2+复性处理,其酶活只有初始酶活的28%。此外,其成熟体还含有典型的丝氨酸蛋白酶类催化三联体结构(Asp 39-His 69- Ser 224)和两对二硫键。蛋白酶K对尿素具有较强的耐受性,低浓度SDS对其活性影响较低,高浓度影响较大,PMSF对其活性具较强的抑制作用。


蛋白酶K被发现以来,有研究者不断被对其结构、性质进行了报道,并实现了蛋白酶K的异源表达(主要是大肠杆菌和毕赤酵母)。此外,研究者们还对如何提高蛋白酶K的表达量、比活性,以及最佳适用量与处理时间(如在原位杂交中的最适用量与处理时间)等方面进行了研究,极大程度地促进了蛋白酶K在工业与科研中的应用。

专家点评

李玉杰,主任技师,同济大学附属东方医院胶州医院检验科主任

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的早期实验室诊断可及时隔离患者及其密切接触者,切断传播链。同时,早期诊断和治疗可使患者有更好的预后。目前,新冠核酸检测受到采样时机,标本类型,标本保存转运,试剂检测限,核酸降解,PCR抑制等各方面的原因,其阳性率一直不理想。多中心研究表明,PK预处理在处理复杂样本中可提高核酸提取效率,各类指南、政策文件也明确提出了PK预处理的临床应用情况,各个核酸检测实验室应严格遵照执行。




【参考文献】

[1] WONGSH, LUIRN, SUNGJJ. COVID-19andtheDi- gestivesystem[J].JGast roenterolHepatol,2020,35(5):744-748.

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[3]钟慧钰,赵珍珍,宋兴勃,等.新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验[J].国际检验医学杂志,2020,41(5):523- 526

[4]杜栩彬,孔玲玲,文纤纤等.不同预处理方法对粪便中新型冠状病毒核酸检测结果的影响[J].临床辅助检查,2020,36

(28) : 106- 107.

[5] KHELAIFIAS,RAMONETPY,BEDOTTOBM,et al.Asemi-automatedprotocol forArchaea DNA extrac- tionfromstools [J]. BMCResNotes,2013,6:186. [6] YUF,QIUT,ZENGY,etal. Comparativeevaluationof threepreprocessi ngmethods

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Med(Lausanne),2018,5(1):56.

[7] SUNGH, YONGD,KICS,etal. Comparativeevaluation ofthreehomogeniz ationmethods

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tumsamplesforreal-timereversetranscriptionPCR[J]. AnnLabMed,201 6,36(5):457-462.

[8]2019新型冠状病毒核酸检测专家共识[J].中华医学杂志.2020(13):968-969.

[9]《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》

[10]《新型冠状病毒肺炎防控方案(第九版)》

[11]王念,巫丽娟,周易,等.蛋白酶 K 预处理在SARS-CoV-2核酸提取中的应用探讨[J].国际检验医学杂志,202 1,41(1):30-33.

[12] GOLDS CHMIDTP,DEGORGES,MERABETL,etal. Enzymatictreatmentofsp ecimensbefore

DNA extraction directlyinfluences moleculardetec tionofinfectiousa- gents[J].PLoSOne,2014,9(6):e94886.

[13] JEDDIF,PIARROUXR,MARYC.Applicationofthe NucliSENSeasyMAGsyst emfornucleicacidextraction:optimization of DNA extractionformole culardiagnosis of parasiticandfungaldiseases[J].Parasite,2013,2 0(2):52.


来自: 检验之声
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