找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

  • QQ空间
  • 回复
  • 收藏

【标准・方案・指南】儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识 ...

归去来兮 2022-3-22 461人围观 医学



者:谢正德1 邓继岿2  任丽丽3 张燕4 陈祥鹏1 张海邻5 赵林清6 徐保平7 钟礼立8 秦强7 卢根9 郑跃杰10 赵德育11 尚云晓12 曹玲13 陈志敏14 殷勇15 刘瀚旻16 申阿东17 应斌武18 符州19 李昌崇5 钱渊6 许文波4 王健伟3 申昆玲7,10
通信作者:申昆玲,Email:kunlingshen1717@163.com;王健伟,Email:wangjw28@163.com;许文波,Email:wenbo_xu1@aliyun.com
作者单位:1国家儿童医学中心,首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,国家呼吸系统疾病临床医学研究中心,中国医学科学院儿童危重感染诊治创新单元,北京 100045;2深圳市儿童医院感染科,深圳 518038;3中国医学科学院&北京协和医学院病原生物学研究所,卫生部病原系统生物学重点实验室,北京 100730;4国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室,世界卫生组织西太平洋地区麻疹/风疹参比实验室,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所麻疹室,北京 102206;5温州医科大学附属第二医院育英儿童医院儿童呼吸科,温州 325027;6首都儿科研究所病毒学研究室,儿童病毒病病原学北京市重点实验室,北京 100020;7国家儿童医学中心,国家呼吸系统疾病临床医学研究中心,首都医科大学附属北京儿童医院呼吸科,北京 100045;8湖南省人民医院儿童医学中心儿童呼吸病学湖南省重点实验室,长沙 410005;9广州医科大学附属妇女儿童医疗中心呼吸科,广州 510623;10深圳市儿童医院呼吸科,深圳 518038;11南京医科大学附属儿童医院呼吸科,南京 210008;12中国医科大学附属盛京医院小儿呼吸内科,沈阳 110004;13首都儿科研究所附属儿童医院呼吸科,北京 100020;14国家儿童健康与疾病临床医学研究中心,浙江大学医学院附属儿童医院呼吸内科,杭州 310052;15上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心呼吸科,上海 200127;16四川大学华西第二医院儿科,出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室(四川大学),国家卫生健康委员会时间生物学重点实验室(四川大学),成都 610041;17国家儿童医学中心,国家呼吸系统疾病临床医学研究中心,首都医科大学附属北京儿童医院,北京市儿科研究所,北京 100045;18四川大学华西医院实验医学科,成都 610044;19重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心,儿童发育疾病研究教育部重点实验室,国家儿童健康与疾病临床医学研究中心,儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地,儿科学重庆市重点实验室,重庆 400014
本文刊发于 中华实用儿科临床杂志,2022,37(5):321-332.
引用本文:谢正德,邓继岿,任丽丽,等.儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识[J].中华实用儿科临床杂志,2022,37(5):321-332.DOI:10.3760/cma.j.cn101070-20211222-01490.

摘要
急性呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病,严重威胁儿童生命健康。快速准确的病原学诊断对于该类疾病的临床诊疗及防控具有重要意义。核酸检测方法因具有较高的灵敏度和特异性,得以快速地在临床推广应用,成为呼吸道感染病原体诊断的主要方法。为规范儿童呼吸道感染病原体核酸检测的临床应用,提升病原体的诊断水平,特组织相关领域专家,撰写《儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识》,以指导儿童呼吸道感染病原体的核酸检测,整体提升儿童呼吸道感染病原体的诊断能力。
关键词
儿童;急性呼吸道感染;病原体;核酸检测;共识


急性呼吸道感染是儿童最常见的感染性疾病,急性下呼吸道感染是5岁以下儿童病死的首位原因,严重威胁儿童生命健康,对家庭和社会造成了严重的疾病负担[1]
儿童呼吸道感染的病原复杂多样,包括病毒、细菌、非典型病原体、真菌等(常见病原体见附录)。近年来,新型冠状病毒、禽流感病毒等新发再发呼吸道感染病原体也对儿童生命健康造成了严重威胁。明确感染病原有助于抗微生物药物的合理使用及呼吸道传染病的早发现、早隔离、早报告和早治疗。因此,快速准确的病原学诊断对于呼吸道常见感染性疾病的临床诊疗及防控具有重要意义。
儿童呼吸道感染病原体检测方法包括分离培养、抗原检测、核酸检测和抗体检测等,各种方法均有各自的优缺点。由于病原体分离培养费时费力且敏感性较低,血清抗体检测因有窗口期不推荐使用,故呼吸道感染病原体的主要实验室诊断方法为抗原检测和核酸检测。核酸检测方法因在不同的疾病期均具有较高的灵敏度和特异性而得以快速地在临床推广应用,成为呼吸道感染病原体诊断的主要方法。多重核酸检测的合理使用,不仅有利于儿童呼吸道感染的病原学辅助诊断,同时也会为病原体的鉴别诊断及医院内感染的防控提供强有力的支持;宏基因组测序技术(metagenomics next generation sequencing,mNGS)为未知病原的明确提供了可能。
为规范儿童呼吸道感染病原体核酸检测的临床应用,提升儿童呼吸道感染病原体的诊断水平,实现国家卫生健康委制定的《2021年国家医疗质量安全改进目标》中“提高呼吸道病原核酸检测率”的目标,特组织临床微生物学、分子生物学、临床医学及检验医学等各相关领域专家,结合国内外文献最新进展,形成《儿童呼吸道感染病原体核酸检测专家共识》,以指导儿童呼吸道感染病原体的核酸检测,整体提升儿童呼吸道感染病原体诊断能力。
1
呼吸道病原体核酸检测方法
病原体核酸检测方法以是否依赖于基因组序列特征分为基因组序列依赖性和非依赖性两类方法。病原体基因组序列依赖性核酸检测方法是根据已知的病原体基因组序列,设计特异性引物,靶向性地进行病原体核酸扩增和检测的方法,如常规的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)。病原体基因组序列非依赖性核酸检测方法不需要根据病原体基因组序列设计特异性引物,而是对样本中的病原体序列进行高通量测序,将获得的序列与数据库中序列进行比对分析而确定病原体的方法,如mNGS 。病原体核酸检测方法按照技术原理又可分为核酸扩增、核酸杂交、基因测序、规律成簇的间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术等。核酸扩增包括PCR扩增、等温扩增技术等。以PCR为主的核酸扩增技术因其高效特异、使用灵活、操作相对简单且成本低的优势,成为当前呼吸道病原体核酸检测最普遍的核酸诊断方法。靶向多种病原体的多重标靶设计以及与核酸提取、扩增、结果读取一体化设备的研发应用,凸显核酸检测在病原体多重快速检测方面的优势。覆盖呼吸道感染常见病原体及耐药基因的核酸检测,可为临床提供病原体诊断依据,有助于优化诊疗。根据分析PCR产物的技术平台不同,又可分为荧光法、毛细管电泳法和质谱分析法等,其中荧光法是最常用的方法。
核酸杂交,如基因固相和液相芯片技术以及基因测序技术因操作相对复杂,对设备及人员要求高,不适合在临床大规模使用,可根据实际情况选择应用。CRISPR技术是一种新兴的检测手段,尚未在病原核酸检测领域普及。常见的核酸检测方法概述如下。
1.1 病原体基因组序列依赖性核酸检测方法 采用靶向病原体基因组的引物,通过链特异性延伸、杂交、编辑等方式实现靶向目标序列的扩增,获得可被检测到的信号,这是病原体检测常用的技术方法。常用的方法包括以下几类。
1.1.1 实时荧光定量PCR(real-time PCR) 实现了PCR从定性到定量的飞跃,使用荧光报告分子来检测每一轮PCR扩增过程中的产物。该方法将核酸扩增和检测步骤相结合,无需对扩增产物进行凝胶电泳,具有简单、特异性和灵敏性高、重复性好、定量准确、速度快等诸多优点。
1.1.2 等温扩增技术 该技术具有操作简单、快速、高效、特异、无需专用设备的优点,较适用于基层和现场检测。代表性技术有环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)和核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence based amplification,NASBA)。LAMP使用具有链置换特性的BstDNA聚合酶,在等温条件下高效、快速、特异性扩增靶标序列[2]。基于LAMP技术开发的呼吸道病原体检测方法已有商品化试剂。NASBA技术是一种检测RNA的等温扩增方法,一般在42 ℃完成扩增,需反转录酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶和序列特异性引物来完成。NASBA尤其适用RNA病毒的检测[3-4]。目前有基于NASBA技术检测常见呼吸道病毒和流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌的方法,用于辅助诊断[5-6]。扩增产物的鉴定可以通过颜色、浊度、胶体金技术或与化学发光、荧光、芯片检测设备结合进行一体化检测。但等温扩增技术扩增体系的稳定性和方法的成熟度不及传统PCR方法。如LAMP技术对引物设计要求高,对扩增靶序列的长度有限制,一般不能进行长片段的扩增;NASBA技术反应体系和组分相对复杂,需要多种酶反应,增加了检测成本。
1.1.3 核酸即时检测(point-of-care testing,POCT)技术 核酸POCT因快速、自动、整合从细胞裂解、核酸提取扩增到产物分析的全部测定步骤,降低检测复杂性,有效防止交叉污染等优点,是病原学检测最受关注的发展方向[7]。核酸POCT与real-time PCR方法比较,在敏感性和特异性方面并无显著差异[8]。欧美国家核酸POCT产业发展较为成熟[9],最为成熟的呼吸道感染病原临床检测是针对耐药型结核杆菌,甲、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的多联检测体系,覆盖20种以上呼吸道病毒和细菌的多联检测体系正逐步推广。2020年的新冠肺炎疫情推动了病原体核酸POCT的快速发展,严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)被迅速列入各POCT联合检测体系中。高质量国产核酸POCT的临床推广应用和前景仍是目前分子诊断领域发展的热点[10]
1.2 病原体基因组序列非依赖性核酸检测方法 mNGS是非序列依赖的新型核酸检测方法,是新发突发传染病和临床未知病原体鉴定的重要技术方法。mNGS是用高通量测序平台对感染部位样本中提取的核酸进行高通量测序,通过将测序数据与数据库序列的比对分析,获得样本中包含的病毒、细菌、真菌和寄生虫等的病原微生物种类。
该方法不依赖特异性的引物扩增[11-12],以非序列依赖、无偏倚性、适用于各种临床样本等特点,在呼吸道感染的病原体检测和研究中具有较其他分子检测技术不可比拟的优势[13-15]。对于儿童呼吸道感染,在病因不明且病情危重需要尽快明确病原体、疑似新发或特殊病原体感染、传统微生物检测技术多次阴性且治疗效果不佳等情况下,可以在常规病原检测的同时或在其基础上对样本进行mNGS分析,以高效获取感染病原体的信息。
mNGS在临床的应用仍面临较大的挑战,尤其在呼吸道感染疾病领域[14-16]。原因包括以下几点:(1)基于mNGS方法的实验操作步骤多且较复杂,有一定技术难度[14];(2)宿主或环境噪音信号较多,检测结果容易受到人源宿主及环境物种遗传物质的干扰,影响有效病原体数据的获取[17-18];(3)mNGS技术检测样本中的核酸(包括 DNA与 RNA),无法完全区分检测到的微生物是否为感染病原体,结果的解释需结合临床综合判断;(4)报告解读复杂,下机数据的分析及结果报告应由临床专业人员结合患儿临床背景、影像学资料、其他的实验室检查结果综合判断其临床意义。此外,mNGS方法的质量控制和标准化评价方法有待完善。由第三方实验室开展的临床样本mNGS检测,需强化过程监管,亟需开展我国病原mNGS临床应用的科学质量评价体系和标准化的评估方法。我国相关监管部门开始建立相关技术标准,强化对mNGS检测产品的规范化[19-20]
2
呼吸道病原体核酸检测推荐人群
根据各种核酸检测方法的优缺点,对呼吸道病原体核酸检测适用的人群推荐如下。
2.1 门诊患儿 (1)急性上呼吸道感染患儿,一般不常规进行呼吸道病原体的核酸检测,但对于有特异性抗病毒药物的病毒感染,如流感病毒,可视条件或在其他检测方法不能明确诊断时,使用核酸检测,有利于抗病毒药物的合理应用。(2)急性下呼吸道感染患儿,或有心肺等重要脏器的基础疾病、免疫功能异常的急性呼吸道感染患儿,建议根据患儿年龄、临床特征和发病季节等及时选用可疑病原的核酸检测方法进行病原学确定,尽快明确病原体,有助于患儿治疗方案的确定和后续管理。
2.2 急诊及住院患儿 (1)对有急诊适应证及所有因急性呼吸道感染性疾病住院、住院期间新出现呼吸道感染症状(伴或不伴发热)、或出现不明原因的呼吸窘迫、慢性心肺疾病急性恶化、血液病、肿瘤患儿出现中性粒细胞减少/缺乏伴发热的,应根据年龄、临床特征和发病季节等,推荐选择核酸检测方法进行病原学诊断,为鉴别诊断需要可采用多重核酸检测。(2)有急性呼吸道感染的危重症患儿,建议首选多重核酸检测。若常规核酸检测不能明确病原,推荐采用mNGS进行病原学检测,但其结果需要结合临床表现综合分析,必要时使用其他方法进一步验证。
3
呼吸道病原体核酸检测的标本类型及选择
3.1 适宜标本类型 (1)上呼吸道标本主要有鼻拭子(nasal swab,NS)、口咽拭子(oropharyngeal swabs,OPS)、鼻咽拭子(nasopharyngeal swab,NPS)、鼻咽吸取物(nasopharyngeal aspirates,NPA)、鼻腔洗液(nasal washing,NW)和咽洗液等。SARS-CoV-2感染流行以来,上呼吸道各种标本的组合也得到了验证,使用OPS和前鼻孔取样的配对采集被证明与NPS采集的效能相当。唾液和咽喉漱口水等非侵入性方法易于采集,并可用于大规模人群监测,也被广泛关注[21]。(2)下呼吸道标本主要为痰、气管吸取物、支气管镜检查获得的标本,包括肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)和保护性毛刷标本等。(3)血液、胸腔积液、组织或局灶穿刺物等标本也可应用病原体核酸扩增检测(nucleic acid amplification test,NAAT)。
3.2 不同病原体检测的标本类型选择 根据使用试剂盒的要求选择合适的呼吸道感染病原体检测的标本类型,对于非试剂盒指定适宜的标本类型,事先应对试剂盒进行适用性评估。
3.2.1 病毒 上、下呼吸道标本及血液、胸腔积液等标本均可用来行病毒NAAT。
3.2.2 细菌 (1)上呼吸道标本通常不推荐用于细菌NAAT。但百日咳鲍特菌主要感染鼻咽部,因此NPS适宜用于百日咳NAAT[22],有报道显示OPS与NPS检测百日咳的敏感性一致[23]。(2)诱导痰、气管吸取物和BALF等下呼吸道标本及无菌体液或组织标本是进行细菌NAAT的适宜标本[24]
3.2.3 非典型病原体 上、下呼吸道标本均适宜于肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌的NAAT,但下呼吸道标本的结果更具病原学诊断价值。
3.2.4 真菌 怀疑下呼吸道真菌感染时,建议采集BALF、无菌体液或组织标本进行真菌NAAT;怀疑真菌性鼻窦炎时可酌情采集鼻窦分泌物和组织标本。
各种标本采集及转运方法见表1,参照美国传染病学会和美国微生物学会2018年更新的“用于传染病诊断的微生物实验室使用指南”修订,供临床医师参考[24]


来自: 中华实用儿科临床杂志
我有话说......