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吓死了!核酸标本突然大量报阳,什么情况?

归去来兮 2021-10-21 137人围观 技术


作者 | 李晓梅

单位 | 腾冲市人民医院检验科



01
前言


“核酸检测”,自新型冠状病毒肺炎(COVID-19)出现以来,已是家喻户晓、老少皆知。而核酸检测阳性是发现新型冠状病毒(SARS-CoV-2)携带者和确诊SARS-CoV-2感染的金标准。[1]面对严峻的新冠疫情,能准确快速筛出阳性病例,更好地做好疫情防控,检验人首当其冲担任了这个光荣而又艰巨的使命。


检验人是这场无硝烟战场上的侦察兵,是疫情防控的重要防线。当前我国疫情防控的重点,已从对本土病例的防控转为对境外输入病例的防控[1]


我市地处边疆,与缅甸毗邻,由于缅甸严峻的疫情局势,为保我国人民的一方健康,“外防输入,内防扩散”,我市各医疗机构在检测本土新冠标本的同时,也帮助缅甸部分临近的省市进行新冠病毒核酸筛查。


筛查标本进入实验室后,陆续有阳性标本被筛出,这就对实验室的检测能力提出了更高的要求。基于我室目前采用的SARS-CoV-2核酸检测方法——RT-PCR法,其检测的特殊性,严格防污染是必然的。那么如何做到防污染保证结果的准确呢?下面就以我实验室的实际案例来分析其中一个防污染的措施。


02
案例经过


由于检测量的增加,加之报告的时限,我们夜以继日轮班奋战在PCR实验室。标本前处理、检测、结果判读、结果分析,是PCR检测的日常。某日在判读夜班老师做的检测结果时(由于白天完成本土标本检测,夜间主要完成缅甸标本的筛查),被扩增曲线吓得心跳飙速,不知所措。来看看具体结果,如(图1)。


(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

图1 夜间检测标本扩增曲线

注:(A)为第一批结果;(B)为第二批结果;(C)为第三批结果;(D)为第四批结果;(E)为第五批结果;绿色曲线为内标曲线,其余为阳性扩增曲线;以下相同。


被吓到,是因为有太多的阳性。但吓归吓,还是要认真分析,并一一复核,最终判读出准确的结果。且看具体分析:


当晚一共检测了5批,从结果曲线来看,同一批次有很多阳性,确切的说是弱阳性。曲线较集中,高次方不多,更多的曲线集中在低拷贝的扩增区(如图2),多个连续标本是阳性;高次方标本周围出现较多低次方扩增曲线;查看阴、阳性对照,并无异常。内对照有扩增,按照结果有效性的判读规则,检测结果有效;但结果是否准确就要打大大的问号了!


图2 第五批相连两排的结果


看完扩增曲线后,直觉告诉我,可能污染了。再根据假阳性的统计质控方法[2],进一步坚定了我的判断!到底是实验室污染,还是操作中操作不当引起的污染呢?[3]具体是那个环节出现了问题?会是阳性质控污染吗?


再次查看阳性质控,每一批的阳性对照周围几个扩增孔都是阴性;阳性质控品污染的可能性不大,当然也不能完全排除。太多弱阳性标本,按照试剂说明书的判读规则,以及新冠阳性结果复检流程必须要一一复核。平复了看到结果时的惊心动魄后,接下来就是对阳性标本进一步复核。


诸多需要复核的标本,无疑是给脆弱的心理增加沉重的负担。但正如古人云“凡遇事须安详和缓以处之,”做到乱中求静,有序进行下一步试验。


首先确定复核的方案。通过仔细分析后,初步判断实验室污染的可能性不大。但为了进一步验证推断,还是对实验室各区环境进行采样,来排除实验室污染的可能。


为保证后续检测顺利进行,紧接着严格按照PCR实验室卫生清洁的要求对实验室各区进行清洁:0.2%的含氯消毒液擦拭台面,不能用含氯消毒液的地方用75%乙醇擦拭,认真清洁实验室。不放过任何一个角落,包括生物安全柜、移液器、离心机、门把手、冰箱拉手等,之后清水擦拭4次,保证无氯的残留而抑制后续的试验。


清洁完成后,重新配置反应体系(并按单份标本量分装好)、提取试剂,移液器吸头全部使用未开封过的,一切准备就绪,开始检测。


严格按照PCR防污染要求操作:缓慢开盖、加样。由于新冠的特殊性,阳性结果必须更加谨慎,加之众多阳性结果,操作时必然是“压力山大”,总当心那个环节出错而导致不同程度异常结果。


为了更早得到非实验室污染的证据,将环境标本和常规标本放在首批(毕竟常规标本阳性率极低),同时也为保证检测效率,在第一批扩增的同时依然进行后一批的前处理。终于第一批结果出来后,可以确定实验室没有污染。结果如图3所示。


图3 当日第一批标本扩增曲线

注:图中阳性曲线为阳性对照


于是,接着将剩余的标本包括当日的常规标本、筛查标本、以及需要复核的标本以同样操作进行。为节约时间,复核试剂同时复核阳性标本。通过紧张操作,终于将当天的标本检测完成。


来看各类型标本检测结果(图4):实验室的常规检测标本全部阴性,阴阳对照正常;初次检测的外来筛查标本,有阳性,拷贝数很高,无低次方扩增曲线;复查的“阳性”标本偶有阴性,但数量不多,依然有很密集的低次方扩增曲线;复核结果与初筛结果无太大变化。


看着扩增曲线的分布情况,根据多年从事PCR检测的经验告诉我,有可能原始标本被污染,当然不排除采样时污染的可能;也可能是真阳性,无论何种原因都必须重新采样复检,尤其低拷贝扩增的标本。


通过谨慎分析后,太多不确定因素,立即报告实验室主任,帮助协调重采标本复核。后经过多方协调,连续几日陆续有复检标本重采样复检,复检结果显示有阳性,但大多是高次方;初检是低拷贝的标本,重采样后,偶尔也有低次方扩增的标本,大多是阴性结果(由于重采标本是在不同时间送检,所以没有统一批次检测,只是根据送检信息与初次检测结果对比),结果被一一证实,确实是初检时原始标本被污染了。如此结果让人胆战心惊!


为了避免再次出现类似情况,即刻对科室所有PCR检测人员再次培训。庆幸的是连续几天都是笔者在做检测,无污染出现。


(A)

(B)

(C)

(D)

图4 当日检测扩增曲线

注:(A)为常规标本扩增曲线,阳性曲线为阳性对照;(B)为常规标本扩增曲线,阳性曲线为阳性对照;红色曲线为内标;(C)为外来筛查标本初检扩增曲线,除一个阳性对照外其余为阳性标本,蓝色曲线为内标;(D)复核标本扩增曲线,红色曲线为内标


03
案例分析


SARS-CoV-2核酸检测,目前多采用RT-PCR检测的方法,该方法是一个能使核酸模板以指数方式进行扩增的过程(能使样品中靶序列的拷贝数特异性地快速扩增105~107倍)[4],一旦污染,有可能导致这个实验室将无法继续开展任何核酸检测试验,同时也会引起一系列的社会效应。


所以PCR检测结果有效性分析是结果分析中重要的质控点,包括原始数据分析、结果有效性分析以及标本结果的判读和复检。[3]在标本结果有效的情况下,对内对照和标本检测结果进行判读,以确定标本的定性和是否需要复检。


此次检测,结果有效;至于结果的准确性就有待进一步确认。PCR检测中可出现假阴、假阳、结果无效等情况,这里主要讨论假阳性。


导致假阳性结果有两个原因[3]:一是以往扩增产物气溶胶产生的PCR实验室污染;二是操作过程中和阳性标本产生的交叉污染。通过验证,此次并非是原因一,而应该是阳性标本交叉污染。


通过分析,导致阳性标本交叉污染的原因如下:



01

移液器与吸头不匹配。在加样时发现,移液器和正在使用的这一批次吸头贴合性差,稍不注意会有漏液的现象。之前加样的老师可能未注意到此问题,可能导致加样时出现了漏液而致阳性标本交叉污染的可能。
02

气溶胶污染。由于震荡混匀后的标本开盖时管口有较多气泡,加样时,阳性标本被戳破的气泡产生气溶胶,而导致污染的可能。
03

由于采用了5ML的采样管,移液器吸嘴部分插入标本管吸液时,碰到管壁,被阳性标本污染后,再次吸取阴性标本时,将阴性标本污染的可能。
04

由于提取板是96孔板,所以加样时动作太快,导致放液时液体喷溅,导致交叉污染的可能。
05

采样后标本管盖子未完全拧紧,导致阳性标本渗漏,导致交叉污染可能。
06

开盖时手套被阳性标本污染,未及时处理,导致标本交叉污染的可能。


造成以上污染的原因可能如下:



01

操作者防污染意识淡薄:由于常规检测几乎无阳性,所以对于操作的细节不重视,当出现强阳性标本时,加样的陋习导致了标本间出现交叉污染。
02

人员培训不到位:由于新加入PCR检测的人员,新冠疫情爆发之前从未接触过PCR检测,疫情开始后也未曾检测到阳性标本,不知道PCR污染的可怕,对操作的细节不重视,日常操作中的陋习带到PCR试验中,由于PCR检测的特殊性,当出现阳性标本时,必然会造成污染。
03

由于采样不规范,造成采样时标本间的污染也是可能的。就此次标本,采样过程无从追踪,所以无法确定分析前是否污染,无从证实。


04
案例总结


PCR实验室一旦出现实验室污染,或标本间的交叉污染,是一个非常头疼的问题,因为一旦污染了,是无法通过“小心地”操作来避免假阳性的结果的。所以最好的办法便是预防污染发生及及时监测到早期轻度污染的出现。[3]


目前国内疫情已取得阶段性的胜利,但纵观全球依然很严峻。对于我们边境地区来说,地理位置复杂,外防输入,依然很严峻,新冠核酸检测已经成为PCR实验室常态化的工作。


国内时有新增病例出现,也时有报道因实验室内不同原因的污染出现假阳性,加之部分边境地区检测能力相对不高,这就对我们的检测人员提出了更高的要求。据我所知,基层的PCR实验室尤其是新建的PCR实验室却又存在以下的实际状况:


第一,检测人员整体理论水平参差不齐,出现污染了,没有被及时被发现,也不清楚是污染还是真阳性。


第二,人员培训不到位。有些检测人员从未接触过PCR检测,匆匆培训后就上岗;各个外部机构的培训也是短期的快速培训,培训合格仅仅只是从事核酸检测的准入门槛,更多的还需要完善针对性的内部培训机制,在实践中不断总结、思考和主动学习。


第三,基层检验人员对于基础的理论知识欠缺,整体知识结构层次不高,同时也缺乏PCR检测的实践经验。当出现异常结果时束手无策,或者不能发现异常结果,更无从谈分析原因。


第四,规章制度和实际脱离,制度的执行力度不够。


PCR检测不同于其他检测,它对操作的要求远高于普通检测,可能一个不经意的动作可能导致错误结果的发生。严格按照PCR的要求执行相关的操作,避免污染。我们不能解决污染,就尽量避免污染的发生!


PCR实验操作中,我们不要做错误结果的创造者,需要做好“三保护”:保护好人员安全,保护好环境安全,同时保护好标本安全!




参考文献

[1]徐英春,胡继红,王瑶,李军,宁雅婷,罗艳萍,周泽奇,林勇平.新型冠状病毒实验室检测专家共识[J].协和医学杂志,2021,12(01:18-26)

[2]李金明 实时荧光PCR技术,[M].第2版,北京:科学出版社2016.9

[3]李金明张瑞 新型冠状病毒感染临床检测技术[M].北京:科学出版社2020.12

[4] 宋秀军,江其生.浅谈临床定量PCR 实验室管理[J].医疗卫生装备,2010,31(02):84.87


END


来自: 检验医学
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