全面解读新冠病毒核酸检测要点，为何会出现假阴性、复检阳性？ ...

作者：刁艳君 杨柳 苏明权 郝晓柯 刘家云

单位：空军军医大学第一附属医院检验科

SARS-CoV-2是一种RNA病毒，基因组序列约29 kb，拥有10个基因，可有效编码10个蛋白。病毒由RNA和蛋白构成，最外层是由脂质和糖蛋白组成的包膜外衣，里面蛋白衣壳将RNA包裹在其中，从而使容易降解的RNA得到保护（图1）。

图1   SARS-CoV-2病毒结构示意

图2   SARS-CoV-2核酸测定（实时荧光RT-PCR）的步骤

注：①为循环阈值（cycle thershold）。

因此，SARS-CoV-2核酸检测（实时荧光RT-PCR）结果阳性是确诊感染的重要证据之一；但如果检测结果为“阴性”，不能作为判断患者未被感染的标准。

有研究结果显示，1100例COVID-19患者在入院时接受电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）检查时，有76.4%的患者呈现出肺炎表现，主要为毛玻璃样阴影（50.0%）和双肺斑片状阴影（46.4%），绝大多数重症患者都能以此确诊^[2]。而根据此前专家表述的“确诊患者中，核酸检测的阳性率仅为30%~50%”来看^[3]，COVID-19患者核酸检测假阴性的比例并不低。因此核酸检测不能作为确诊感染的唯一方法。

核酸检测实验室为负压环境最为理想，应注意压力监测，保持空气流动，排除气溶胶。核酸检测人员必须具备相应资质，接受聚合酶链反应相关培训并考核合格。实验室应严格管理，分区到位，严格禁止无关人员进入。清洁区应保持通风，消毒到位。相关物品分区放置，洁污分离，按时更换，洗消到位。常规消毒：较大面积以含氯消毒液为主，小面积可以用75%酒精。处理气溶胶的良好方式是开窗通风，也可通过紫外线、过滤、空气消毒机等方式进行空气消毒。

SARS-CoV-2核酸测定（实时荧光RT-PCR）的

关键环节和参数

目前应用最广泛的呼吸道样本，如鼻咽拭子等均采用第2种方式，即以核酸提取裂解液为基础配制的灭活（保存）液。这种病毒保存液一方面可让病毒的蛋白变性，失去活性，不再有传染性，提高运输和检测阶段的安全性；另一方面又可直接裂解病毒释放核酸，消除核酸分解酶，防止病毒的RNA降解。

以核酸提取裂解液为基础配制的病毒采样液，主要成分为平衡盐类、乙二胺四乙酸螯合剂、胍盐（异硫氰酸胍、盐酸胍等）、阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）、阳离子表面活性剂（十四烷基三甲基草酸铵）、苯酚、8-羟基喹啉、二硫苏糖醇、蛋白酶K等几种或多种组分。目前，核酸提取的试剂盒种类繁多，采用的核酸提取纯化试剂各不相同，即使是采用相同的核酸提取纯化试剂，各试剂盒的提取程序也有所不同。

目前国家药品监督管理局批准的核酸检测试剂盒产品均基于SARS-CoV-2基因组中ORF1ab、E和N基因进行选择。不同产品的检测原理基本一致，但是其引物、探针设计不同，有单靶区段（ORF1ab）、双靶区段（ORF1ab、N或E）、三靶区段（ORF1ab、N和E）的检测和判读差别，核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系应参考相关试剂盒说明书，并建议使用者严格按照试剂盒说明书规定的判读方式进行判读。实时荧光RT-PCR扩增的常见区域及引物和探针序列如图3所示。

图3   SARS-CoV-2扩增子靶标在基因组上的定位及引物和探针序列

注：①引物及探针序列出自《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案（第二版）》[7]，上述序列在之后的第三版^[8]、第四版^[9]、第五版^[10]中相同

②无相关指南提供引物及探针序列。

SARS-CoV-2核酸测定（实时荧光RT-PCR）

结果判读

之后的第三版指南^[8]、第四版指南^[9]延续了上述标准，但是由于商品化试剂盒选用的靶标有所不同，上述3版指南并未给出靶标的组合判断标准，强调以厂家提供的说明书为准。从第五版指南^[10]开始，明确了2个靶标，尤其是比较难判断的单靶标阳性的判断标准，即实验室要确认某个病例为SARS-CoV-2核酸检测阳性，需满足以下2个条件中的1个：

（1）同一份样本中SARS-CoV-2 2个靶标（ORF1ab、N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性，如果出现单个靶标阳性的检测结果则需要重新采样并重新检测，如果检测结果仍然为单靶标阳性，则判定为阳性；

（2）2种样本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性或同种类型样本2次采样检测均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。但是，指南同时强调核酸检测的阴性结果不能排除SARS-CoV-2感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括样本质量差（口咽等部位的呼吸道样本）、样本收集过早或过晚、没有正确保存、运输和处理样本、技术本身存在问题（病毒变异、PCR抑制）等。

SARS-CoV-2检测出现假阴性的原因

（1）被感染者的细胞中有一定量的病毒。现有数据显示机体被病毒感染后，病毒通过鼻腔和口腔进入到咽喉部，再到气管和支气管，进而到达肺泡，感染者会经历潜伏期、轻度症状、再到严重症状的过程，不同病程阶段以及机体不同部位存在的病毒量有所不同。

从细胞种类的病毒载量看，肺泡上皮细胞（下呼吸道）>气道上皮细胞（上呼吸道）>成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞等；从样本类型来看，肺泡灌洗液（最优）>深咳痰>鼻咽拭子>口咽拭子>血液。此外，粪便中也能检出病毒。但是考虑操作的方便性和患者的接受程度，目前临床常用的样本顺序是口咽部拭子>鼻咽部拭子>支气管灌洗液（操作复杂）和深痰（常为干咳，难得到）。

因此，某些患者口咽部或鼻咽部细胞中病毒量较少或极低，如果只取口咽部或鼻咽部样本检测，病毒核酸就检测不到。

（2）样本采集时未采集到含有病毒的细胞，或未有效保存病毒核酸。

（3）体外诊断试剂性能不佳。部分品牌的试剂由于研发时间短，也没有使用已知临床样本进行必要的性能确认，可能存在对试剂优化不充分以及试剂批间差异大等问题。此外，国家卫生健康委临床检验中心2020年3月16—24日开展的SARS-CoV-2核酸检测室间质量评价^[12]发现，各“检测”试剂均存在与多个核酸“提取”试剂搭配使用的情况，这也是导致假阴性结果的主要原因。即使采用同一核酸检测试剂，由于核酸提取试剂的不同，分析敏感性也必然会存在差异。

（4）临床实验室操作不规范。样本运输保存条件、临床实验室的规范操作、结果判读和质量控制等是保证检测结果准确、可靠的关键因素。国家卫生健康委临床检验中心2020年3月16—24日开展的室间质量评价结果显示，收到有效结果的844家实验室中，701家（83.1%）合格，143家（16.9%）不合格，实验室总体检测情况良好^[13]，但不同实验室在人员操作能力、单靶标阳性样本解读能力以及质量控制方面仍存在差异。

如何降低SARS-CoV-2核酸检测假阴性？

康复出院患者SARS-CoV-2核酸检测

复检阳性的原因

总结

来源：《检验医学》杂志 2021, 36(3): 352-356