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浅谈新冠病毒核酸检测和检测的假阳性、假阴性

归去来兮 2021-8-24 337人围观 杂谈



【核酸的基本知识】


新冠肺炎疫情暴发以来,“核酸”的大名“如雷贯耳”、老幼皆知,到底什么是核酸呢?


核酸就是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的总称,是遗传信息的携带者。简而言之就是个生命体最核心最特异的物质,由于核酸的唯一性,因此可以用来区分鉴别某种病毒的存在,核酸检测作为目前诊断新冠肺炎的“金标准”。


新冠肺炎的诊断手段有多种,病史、临床症状、影像学检查,但是都不具有唯一性,唯有“核酸检测”可以做到。


下面是国家卫健委对新冠肺炎诊断的说明,见于《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版修订版)》


诊断原则

根据流行病学史、临床表现、实验室检查等进行综合分析,作出诊断。新型冠状病毒核酸检测阳性为确诊的首要标准。未接种新型冠状病毒疫苗者新型冠状病毒特异性抗体检测可作为诊断的参考依据。接种新型冠状病毒疫苗者和既往感染新型冠状病毒者,原则上抗体不作为诊断依据。


诊断标准

疑似病例具备以下病原学或血清学证据之一者:

(1)新型冠状病毒核酸检测阳性;

(2)未接种新型冠状病毒疫苗者新型冠状病毒特异性IgM 抗体和IgG 抗体均为阳性。


【核酸检测的基本知识】


随着疫情的需要越来越多的检验人加入核酸检测队伍,虽然做过培训,但是很多人仅仅会简单的操作,而对核酸检测的原理和PCR仪知识的了解很缺乏,下文笔者尝试从最基础的知识谈起。


荧光PCR法(第二代PCR技术)是病毒检测的主流方法,也是目前我国新冠病毒检测采用最多的技术,其中实时荧光定量PCR法最常用。


上面几张图是实时荧光定量PCR仪的操作界面,其中可以看到FAM通道,VIC通道,CY5通道,N基因,ORF1ab基因,内标基因,Ct值这些名词,这些又是是什么意思呢?相互之间又有什么联系呢?


下面用一个表格来简单说一下



N 基因和ORF1ab基因

都是特异性基因,不会跟其他病原体重叠。设计时候,两个基因的序列不一样,导致灵敏度不一样,N基因的敏感性比ORF1ab基因高,但是特异性不如ORF1ab基因。


Ct值

(Cyclethreshold,循环、阈值的英文缩写)其含义是:在PCR循环过程中,每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高,Ct值越小;起始模板量浓度越低,Ct值越大。


看下面图示



内标基因

也称管家基因,通常选择在生物体各类细胞都能表达的基因,用于流程质控,但它的高表达性,也不能保证采样的准确性,想要采集合格的鼻咽试子还得规范的操作规程和技术规范。只有高质量的标本,内标基因才能发挥其流程质控的作用。


【结果分析】


01
ORF1ab基因(+)和N基因(+)双阳性:

如果有新冠肺炎症状,可报告“检出”;

如果临床症状不支持,建议用其他试剂复检,仍阳性报“检出”;

否则,考虑假阳性可能。


上图为ORF1ab基因和N基因双阳性,内标基因阳性


02

ORF1ab基因(+) 或者N基因(+)单阳性:

建议重新采样检测


如果该基因仍阳性且临床症状支持,可报告“检出”;

如果临床症状不支持,建议用其他试剂复检,仍阳性报“检出”;

否则,考虑假阳性可能。


上图为ORF1ab基因或N基因单阳性,内标基因阳性


03
ORF1ab基因(-) 和N基因(-)双阴性:

核酸检测结果为阴性,但是也存在假阴性的可能。


上图为ORF1ab基因和N基因双阴性,内标基因阳性


04
内标基因(-):

采样不合格,需要重新采样检测。


上图为ORF1ab基因、N基因、内标基因都是阴性。


【核酸检测的“不靠谱”】


核酸检测是确诊新冠肺炎的“金标准”,但是经常会看到这样的新闻:核酸检测了十几次才确诊阳性,还有刚开始检测为阳性,再进一步检查为阴性,为什么所谓的“金标准”还那么不靠谱?


所谓“金标准”是指当前临床医学界公认的诊断疾病的最可靠方法,可以正确的区分“有病”或“无病”。但不是100%,受人为的主观因素、客观因素的影响,比如核酸检测,核酸采样的不标准,病毒载量低等。





(一)假阳性


什么是假阳性?是指因为种种原因把不具备阳性症状的人检测出阳性的结果。


1、实验中阴性对照、空白对照出现了“翘尾”现象,甚至是明显的“阳性”扩增曲线。(实验室污染的可能性大)


上图可见阴性对照实验也出现了ORF1ab基因和N基因阳性


上图可见空白对照出现了翘尾现象


2、标本检测为阳性,但是流行病学史和临床症状不支持新冠的诊断,再次检测或多次检测结果均为阴性。(可能存在标本被污染或者或者标本顺序被弄混)


什么原因会导致新冠肺炎核酸检测假阳性?


1、实验室结构的问题。

2、操作程序不严谨,将扩增产物带入样本制备及加样区域。

3、生物安全柜可能会存在核酸污染。

4、疫苗引起的“假阳性”。


如何应对实验室检测的“假阳性”?


1、优化实验室结构

严把实验室工程建设质量关,杜绝分区之间漏气的情况。时常检查实验室传递窗及周围,两分区之间互通的墙壁插座,墙壁、地面等部位是否存在缝隙,及时妥善封闭。


经常观察各区的压力表、计算各区之间的压差是否在正常范围之内,如发现异常及时处理。扩增区对完成的PCR反应管密闭丢弃在医疗垃圾桶,严禁开盖。


比较理想的结构是在独立于PCR实验室的二级生物安全实验室进行核酸提取及加样,然后将加样的反应体系转运至扩增室进行下一步的实验。这样既可以避免扩增产物对样本制备过程的污染,也可以避免样本制备区泄漏的生物安全风险。


2、严格按照PCR分区操作,各分区的防护服、手套、消毒喷壶、离心机、加样枪等坚决不能混用,特别要注意一些清洁用品,如拖把、抹布等更是不能混用。


3、在生物安全柜加样操作时待检样本核酸产物和阳性质控品可放在不同区域进行操作,阳性质控品加样可不在生物安全柜内操作。若生物安全柜发生核酸污染,则需要更换高效过滤器,或使用可靠的核酸清除降解试剂进行处理。


4、新冠疫苗接种点要远离采样点;新冠疫苗接种人员和采样工作人员坚决不能兼职操作;在接种工作台面上铺一次性无纺布,定期清理;按压的棉签不要带走,按医疗废物在接种点统一收集处理;发生安瓿破裂等现象及时处理,防止污染扩散;医疗机构环境监测避免在接种点采样检测。





(二)假阴性


什么是假阴性?就是指某项检查的结果实际应该是阳性,但由于操作、仪器、个人身体特性等原因导致结果呈阴性。


重复检测多次阴性后出现阳性结果、咽拭子标本多次检测阴性但最后在呼吸道灌洗液标本中检测出阳性结果、核酸检测阴性但CT影像筛查出现新型冠状病毒肺炎特征。


实际应该是阳性的标本,检测却是阴性。



什么原因会导致新冠肺炎核酸检测假阴性?

01
病毒载量低的问题

采样时期的影响:感染初期、患者逐渐康复后、间歇性排毒患自身携带病毒载量较低,可能造成检测“假阴性”。


采样部位的影响:肺泡灌洗液、深部痰>鼻拭子>咽拭子 采样深度、力度均影响病毒载量。


02
检测试剂的问题

核酸提取的效率与纯度,体外诊断试剂灵敏度差异,病毒变异性等因素。

03
其他问题

操作不够规范,临床实验室不够规范等。



如何应对实验室检测的“假阴性”

01
患者病程

不同病程期间,患者机体中的病毒载量不同。例如感染初期,患者自身携带病毒载量较低,可能造成检测“假阴性”。

患者逐渐康复后,病毒载量也逐步降低,此时核酸检测阳性率随之下降。面对这种情况,建议在不同时期进行多次核酸检测,对重点人群进行定期核酸检测,并做好临床观察与数据总结。


02
采样部位

采集肺泡灌洗液、深部痰优于鼻咽拭子,采集鼻拭子优于口咽拭子。为保证结果准确性,建议采用鼻咽+口咽拭子的方法,即同时采集鼻咽及口咽拭子进行检测。

03
采样准确性

采样深度、力度要够,鼻咽、口咽拭子采集,均需取到较深部的上皮细胞,才可能能够检测到病毒存在。

04
检测试剂盒质量差异

现如今检测试剂盒的质量存在一定的差异。随着共同的努力和技术的不断优化进步,会逐渐的改善。因试剂问题造成的假阴性或者假阳性,可以换不用批号或厂家的试剂做对比检测。

05
其他方法

疑似病例新冠病毒核酸检测阴性者,可进行IgM抗体检测,作为补充诊断的指标。(新冠病毒IgG抗体检测也用于判断是否曾经被感染)


END

来自: 检验医学 | 作者:吕蒙
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