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超全汇总!核酸检测实验室污染源、防污染措施及权威处理方案 ...

归去来兮 2021-8-23 119人围观 机构


近期随着德尔塔毒株疫情的再起,高强度的核酸检测任务已然成为了我们检验人的工作常态,核酸检测实验室污染问题也是大家近期比较关心的话题。


本文整理总结了核酸检测实验室污染原因、防污措施、污染的监测及解决方案等问题

01
PCR 实验室的潜在污染来源


①临床标本中存在的大量待测微生物或待测靶核酸

②科研中得到的质粒克隆

③以前分析研究的特定微生物或靶核酸

④大量存在于实验环境中的特定微生物或靶核酸

⑤以前扩增产物的残留污染,这也是 PCR 实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染”。 


PCR扩增可以引起实验室中扩增产物的累积,通常一次典型的PCR 扩增可以产生109拷贝的靶序列,如果气溶胶化,甚至最小的气溶胶都会含有106拷贝的扩增产物。如果不加以控制,在短期内累积的气溶胶化的扩增产物即会污染实验室中的试剂、仪器设备和通风系统,从而造成严重的实验室“污染”,出现大量的假阳性结果。




02
PCR 实验室的防污染措施


进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。


(一) 划分操作区


目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:

1.  试剂准备区。

2.标本制备区。

3.  PCR扩增区及分析区。

各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:试剂准备→标准制备→PCR扩增区及分析区。

切记:任何一间的产物及器材不要拿到其他两个工作区。


(二) 分装试剂


PCR扩增所需要的试剂均应在生物安全柜、装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA:

1.PCR用水应为高压的双蒸水;

2.引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制;

3.引物和dNTP应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。


(三) 实验室的严格分区及工作程序的严格遵守


试剂准备区、样本准备区、扩增区、检测区等必须备有其各自必需的仪器设备、工作服、手套、加样器和通风系统。在每个区使用的试剂和废物,必须直接在其各自的区域内分装或包装。操作人员必须注意防止通过他们的头发、眼镜、首饰和衣服将扩增产物从污染区携带至清洁区的可能性。


(四)化学方法


实验台面可使用10%的次氯酸钠(漂白剂)清洗,然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸钠。次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作用,从而使可能的留在实验台面的扩增产物被破坏掉。要注意的是,次氯酸钠不能区分提取的目的 DNA 和 PCR 扩增产物,用次氯酸钠处理的样本不能用于核酸扩增检测。在实际工作中,有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时,在转回之前,应将其置于2%~10%的次氯酸钠溶液中过夜,并充分冲洗。


(五)扩增产物的修饰


如对以前扩增产物进行适当修饰,应可以消除其污染后面新的扩增检测,但为保证不影响靶核酸的扩增检测,扩增产物修饰方法必须遵循两个基本原则:

一是扩增产物被修饰后,应可以与随后打增的靶序列区分

二是修饰不能干扰正常的扩增检测。


不同消除扩增产物污染的方法优缺点比较

图片来自《实时荧光PCR技术》


(六) 实验操作注意事项


尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:

1.  戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;

2.  使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;

3.  避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;

4.  操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;

5.  最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;

6.  操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;

7.  尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;

8.  重复实验,验证结果,慎下结论。



03
实验室污染的监测

一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。


对照试验


1、阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性  对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳  定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。


2、阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。②试剂对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染。


3、重复性试验


4、选择不同区域的引物进行PCR扩增



04
实验室污染的消除


实验室一旦发生污染,检测工作应立即停止,直到确认消除污染后才能重新开始检测。首先,要查找污染源和明确污染范围。然后,根据污染源和污染范围采取有效的去污染措施,结合各种不同方法以达到最佳效果。


1.标本污染生物安全柜的操作台造成局限污染时:


立即用吸水纸覆盖,并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配,24小时内使用。


2.标本倾覆造成实验室污染时:


保持实验室空间密闭,避免污染物扩散。立即使用润湿有0.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。必要时(如大量溢撒时)可用过氧乙酸加热熏蒸实验室,剂量为2g/m³,熏蒸过夜;或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾,用量8ml/m³,作用1-2小时;必要时或用高锰酸钾-甲醛熏蒸:高锰酸钾8g/m³,放入耐热耐腐蚀容器(陶罐或玻璃容器),后加入甲醛(40%)10ml/m³,熏蒸4小时以上。熏蒸时室内湿度60%-80%。


3.清理污染物时:


严格遵循活病毒生物安全操作要求,采用压力蒸汽灭菌处理,并进行实验室换气等,防止次生危害。



05
新冠病毒核酸检测常见问题


1、新冠试剂出现翘尾,怎么处理?


答:如果是个别单一通道翘尾,不管是FAM还是VIC通道,首先按照要求复查,复查建议重新采样,如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证,如果复查阴性判读阴性,如果复查还是同一通道翘尾,就要对结果仔细审核,一是要排除实验室污染,二是要对病人信息了解清楚,从临床症状及接触史排查,如果没法确认,建议必须重新采样复查,如有必要可以采用另一家试剂来验证。如果出现大量的弱阳性扩增翘尾,首要原因是考虑实验室污染,可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。


2、N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗,灵敏度哪个更高?是否会和其他冠状病毒片段重叠?


答:N基因跟1ab都是特异的,不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。设计时候,两个基因的序列不一样,导致灵敏度不一样,N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。


3、新冠检测结果和临床诊断不符合,怎么解读?


答:新冠病毒由于是RNA病毒,容易降解,另外检测结果也和取样,核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关,需要逐一分析,同时可以结合临床症状判读。


4、采用生理盐水做阴性对照,内标也会增长,怎么解释?


答:因为试剂采用的是内源性内标,内源性内标是用人源基因标记,此基因存在于人的表皮细胞内,操作过程中就可能会出现人源性的污染,另外环境污染也有可能导致内标增长,这也是前面提到的建议做环境样本质控。


5、新冠样本内标不出如何处理?


答:如果新冠样本内标不出,该样本必须复查,可重新混匀该样本提取核酸,如果重新提取该样本内标还是不出,在排除提取问题的情况下,说明采样不合格,要通知临床重新采样复查。


6、采集环境样本检测新冠状病毒,为啥大部分样本内标不出,偶尔个别样本检测出内标?


答:因为新冠试剂检测的是人内源性内标,环境样本一般不含有人源细胞,所以检测不出内标;偶尔检出内标,可能该环境样本上有人源性细胞粘附,故而检出内标。




最后是两条有用的小诀窍:


● 面对多份样品,制备反应混合液时,先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后用分液功能进行分装。

● 在加入模板时,按照“阴性对照-待测样品-阳性对照”的加样顺序,操作上应遵循“开管盖-加模板-盖管盖”的原则。



本文由检验医学整理自:

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

《医疗机构新冠病毒核酸检测工作手册》(试行第二版)

《实时荧光PCR技术》(第二版)


来自: 检验医学
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